對于CRISPR介導的基因編輯，Cas9核酸酶通過特異性的gRNA作用至靶位點以產(chǎn)生DNA切割。在大多數(shù)情況下，為了實現(xiàn)簡單的基因敲除，可以將單個gRNA與Cas9共同使用以產(chǎn)生DSB，然后通過NHEJ進行低效率的DNA修復，從而導致序列發(fā)生永久性突變，比如產(chǎn)生基因的小片段插入或堿基缺失。這類突變的一部分會導致基因的閱讀框移碼、出現(xiàn)提前終止密碼子等，最終導致目的基因的功能喪失。

雙gRNA則一般用于結合Cas9(D10A)切口酶對靶位點的兩條反向DNA鏈進行切割。在這種方法中，切口酶將在兩條鏈上產(chǎn)生單鏈切割，每一條鏈上的切割位點通過兩條gRNA中的一條引導，然后在靶位點產(chǎn)生DSB。一般來說，這種方法減少潛在的脫靶效應，因為該種DSB的產(chǎn)生要求兩條gRNA同時靶向序列。

當使用Cas9(D10A)切口酶和外源供體 DNA 模板將特定的堿基（例如敲入）引入感興趣的基因時，也可以使用雙gRNA。在這種方法中，兩條反向的DNA鏈將被兩個gRNA靶向位于所需突變位點兩側的兩個位點，然后通過HDR途徑利用外源DNA供體模板來修復切除的序列。

為了確定哪種方法最適合您的實驗應用，以下是您應該考慮的一些事項。

基本原理

• 基因敲低載體

基因敲低載體表達shRNA抑制靶基因的mRNA，通過引發(fā)mRNA的切割抑制翻譯過程。shRNA敲低不改變靶基因的DNA序列。

• 基因敲除載體

CRISPR和TALEN都是通過指導核酸酶切割基因組中的特定靶位點來發(fā)揮作用。然后這些切割位點被細胞低效地修復，從而導致修復部位的永久性突變，比如產(chǎn)生基因的小片段插入或堿基缺失。這類突變的一部分會導致基因的閱讀框移碼、出現(xiàn)提前終止密碼子等，最終導致目的基因的功能喪失。如果同時靶向基因組中兩個相鄰緊密的切割位點（距離幾個kb），也可以導致其間區(qū)域的刪除。

效率

shRNA敲低永遠不會完全抑制靶基因的表達。即使對于最有效的shRNA，靶基因的一些殘留表達也會保留。相比之下，在一小部分經(jīng)過處理的細胞群中，CRISPR和TALEN可以產(chǎn)生永久性突變，這可能導致基因功能完全喪失。

一致性和均一性

shRNA載體通常在轉染/轉導的細胞時獲得較好的均一性，實驗之間的一致性也較佳。相比之下，由于引入突變是隨機的，CRISPR和TALEN的基因編輯效果在細胞之間的差異相當大。為了完全敲除細胞中的目的基因，必須敲除細胞中基因的所有拷貝。鑒于正常細胞具有任何基因的兩個拷貝（X或Y連鎖基因除外），而癌細胞可以具有兩個以上的拷貝，這種完全敲除的細胞可能只占所有處理后的細胞的一小部分。出于這個原因，核酸酶介導的敲除實驗需要通過測序來篩選克隆，以確定所有目的基因拷貝都被敲除的子細胞群。

脫靶效應

已有報道表明shRNA介導的基因敲低和核酸酶介導的基因敲除均會產(chǎn)生脫靶效應。脫靶效應的表征可以通過使用多個不同的shRNA 靶向同一基因來評估。如果一個基因被在多個不同的shRNA作用下仍然表現(xiàn)出一致的表征，則這種表征通常則不是脫靶效應帶來的。對于CRISPR或TALEN基因敲除，應分析含有功能喪失突變的多個克隆，以包含可能由脫靶突變引起的任何表征。此外，可以對克隆進行脫靶位點測序，通過生物信息學方法鑒定以查看它們是否已發(fā)生突變。