雙gRNA文庫要比單gRNA文庫強(qiáng)大的多，這是由于雙gRNA文庫引入的大片段缺失在產(chǎn)生基因功能缺失上更高效。每個慢病毒載體含有一對gRNA表達(dá)盒子，這對gRNA打靶同一個基因。導(dǎo)入Cas9蛋白表達(dá)細(xì)胞后，每個載體能夠在一個基因上產(chǎn)生兩個切口。細(xì)胞修復(fù)這兩個切口的時候，往往傾向發(fā)生兩個切口之間的大片段缺失。這兩個切口通常被設(shè)計在目的基因的重要區(qū)域上，當(dāng)兩個切口之間的片段缺失后，目的基因的功能也會喪失。

對于典型的敲除篩選實驗，CRISPR文庫構(gòu)建可以采用單載體或雙載體系統(tǒng)。在單載體系統(tǒng)中，Cas9或Cas9變體與來自同一載體且與gRNA共表達(dá)，而在雙載體系統(tǒng)中，Cas9或Cas9變體和gRNA由兩個單獨的載體表達(dá)。此外，在雙載體系統(tǒng)中，可以將表達(dá)gRNA的載體引入穩(wěn)定表達(dá)Cas9的細(xì)胞系中。使用單載體系統(tǒng)的優(yōu)點是它無需將兩種不同載體共轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中，并且不要求使用表達(dá)Cas9的穩(wěn)定細(xì)胞系。然而，與雙載體系統(tǒng)相比，它的通用性較差，并且在載體克隆和病毒包裝方面的效率較低。

我們使用的gRNA設(shè)計和評分使用了 CRISPR文庫設(shè)計（CLD）中的規(guī)則。簡而言之，對于每個物種，我們找出符合N(20)NGG規(guī)則的靶序列，把錯配堿基 ≤3的序列列為潛在的脫靶位點，計算出每個gRNA的脫靶分值，進(jìn)而得出最終的gRNA特異性分值。gRNA特異性分值在0-100之間，分值越大靶向特異性越高。

請注意特異性分值只是一個參考值。實際的靶向效率和特異性可能會與預(yù)測的分值有偏差，低分值的gRNA也可能有較好的靶向效果。