我們設(shè)計和評估shRNA的規(guī)則與RNAi consortium（TRC）使用的規(guī)則類似。對于每個RefSeq轉(zhuǎn)錄本，我們會搜索出所有的21 mers作為候選靶位點。以下因素會降低干擾效率/特異性或影響克隆，含有這些特點的序列將會被排除。主要因素包括：含有≥4個連續(xù)相同堿基，含有≥7個G或C，GC含量<25％或> 60％以及序列的5'端含有AA堿基。如果靶點內(nèi)部含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，或是3'末端的GC含量較高，或是該靶點是已知的miRNA核心序列或是會打靶到其他基因，則該靶點的分值就會較低。若靶位點存在于一個基因的多個轉(zhuǎn)錄本，則該靶點的分值就會較高。 所有的干擾分值均≥0，平均數(shù)約為5，標(biāo)準(zhǔn)差約為5，95%的分值均≤15。若一個shRNA的干擾分值是15，則表示具有很高干擾效率且易于克??；若干擾分值為0，則表示干擾效果較差或難以克隆。

請注意干擾分值只是一個參考值。實際的干擾效果可能會與預(yù)測的分值有偏差，低分值的shRNA也可能產(chǎn)生較好的干擾效果。同時，靶向轉(zhuǎn)錄本的 3’ UTR也可以起到干擾作用。

并不是所有的shRNA都會起作用

根據(jù)我們的經(jīng)驗和來自客戶的反饋，使用3-4個shRNA進(jìn)行干擾測試時，通常只有2-3個有比較合理的干擾效果。所以，在使用shRNA時，重要的是要認(rèn)識到并非所有的shRNA都能正常工作。通常情況下，約50-70％的shRNA具有干擾效果，其中只有約20-30％的shRNA具有比較明顯的效果。如果您使用幾個shRNA靶向同一個基因都沒有一個能產(chǎn)生滿意的干擾效果，最好的解決方式是嘗試更多的shRNA，特別是那些經(jīng)過文獻(xiàn)驗證的shRNA。目前，許多研究人員使用靶向相同基因的shRNA庫（即不同shRNA的混合物）進(jìn)行實驗，以期提高干擾效率。

干擾效率檢測方法不當(dāng)

最常用評估shRNA干擾效率的靈敏測定方法是RT-qPCR，您可能需要嘗試幾對引物，篩選出最具特異性和效率的引物對。通常情況下，RT-qPCR引物應(yīng)跨越內(nèi)含子，即設(shè)計在兩個外顯子上，以免擴(kuò)增基因組DNA。當(dāng)使用新引物時，建議您先進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增實驗，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測目的條帶，或者甚至可以通過測序驗證PCR產(chǎn)物是否正確。在進(jìn)行RT-qPCR的同時，應(yīng)注意設(shè)置minus-RT對照以評估基因組DNA的污染水平。您可以使用NCBI引物設(shè)計工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）來檢查引物質(zhì)量。 干擾效率也可以通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）進(jìn)行評估。然而，該方法常產(chǎn)生來自非特異性抗體結(jié)合的假陽性條帶，從而導(dǎo)致誤判沒有干擾效果。因此，在使用時需要確保抗體的特異性。 您使用的shRNA可能只打靶基因的某個轉(zhuǎn)錄本 在設(shè)計shRNA時，我們推薦您使用那些能靶向單個基因多個轉(zhuǎn)錄本的shRNA，除非您只想打靶特定轉(zhuǎn)錄本。VectorBuilder提供針對常見物種的shRNA數(shù)據(jù)庫。當(dāng)您將shRNA元件插入載體時，您可以選擇shRNA數(shù)據(jù)庫，通過搜索目的基因查看所有可用的shRNA詳細(xì)信息。您還可以打開其中的UCSC鏈接，查看shRNA序列在基因組和轉(zhuǎn)錄本中位置等信息。

您使用的shRNA可能只打靶基因的某個轉(zhuǎn)錄本

在設(shè)計shRNA時，我們推薦您使用那些能靶向單個基因多個轉(zhuǎn)錄本的shRNA，除非您只想打靶特定轉(zhuǎn)錄本。VectorBuilder提供針對常見物種的shRNA數(shù)據(jù)庫。當(dāng)您將shRNA元件插入載體時，您可以選擇shRNA數(shù)據(jù)庫，通過搜索目的基因查看所有可用的shRNA詳細(xì)信息。您還可以打開其中的UCSC鏈接，查看shRNA序列在基因組和轉(zhuǎn)錄本中位置等信息。

生物醫(yī)學(xué)研究中慢病毒、AAV以及腺病毒都是常用的病毒載體，它們在應(yīng)用以及性能上各有優(yōu)劣。

下表是當(dāng)您選擇合適病毒時需要考慮的因素：

從細(xì)胞收毒后，如果病毒載體帶有熒光報告基因，我們通常先將病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)一些常見的細(xì)胞系（如293T或293A），觀察熒光的表達(dá)情況，從而檢驗病毒的質(zhì)量。然后根據(jù)病毒類型采取不同的方法來量化病毒的滴度。如果熒光觀察結(jié)果和定量測量之間存在較大差異，我們將進(jìn)行重新測量或額外驗證，以確保生產(chǎn)的病毒是高質(zhì)量的。

慢病毒

我們使用p24 ELISA法測定慢病毒滴度。該方法的三明治免疫試驗可測定HIV-1核心蛋白p24在慢病毒上清液中的含量水平。我們首先在微量滴定板上加入慢病毒樣本，然后每孔加入HIV-1 p24捕獲抗體進(jìn)行孵育，并隨后添加生物素化的p24二抗以結(jié)合p24一抗。此后，樣本中加入的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素可特異性結(jié)合生物素化的p24二抗。在最后一步中，加入辣根過氧化物酶底物反應(yīng)液，經(jīng)HRP催化產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物。每個孔的顏色深度最終反映了慢病毒樣本中的p24含量。使用分光光度計測量的樣本吸光度數(shù)值與重組HIV-1的p24標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，然后被換算為對應(yīng)的慢病毒滴度。

AAV

我們通過裂解AAV病毒顆粒，然后以qPCR測定裂解產(chǎn)物中的AAV基因組拷貝數(shù)（ITR區(qū)域的拷貝數(shù)）來獲取AAV的物理滴度（Physical titer）。AAV病毒顆粒通常十分穩(wěn)定。我們制備的AAV均有活性且能在室溫下多天仍保持功效。因此我們的物理滴度非常接近實際的功能滴度。

腺病毒

對于腺病毒，我們測量的是功能滴度（Functional titer）。在293A細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)梯度稀釋的腺病毒后，我們使用我們采用基于免疫化學(xué)的方法對轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)來代表病毒滴度。這些細(xì)胞包含了腺病毒特異性六連體蛋白（Ad5 hexon protein），并且每個細(xì)胞被看作一個感染單位。細(xì)胞在非常低的感染復(fù)數(shù)的條件下被轉(zhuǎn)導(dǎo)，以保證每個細(xì)胞只被一個腺病毒感染。這種實驗方法與傳統(tǒng)的噬菌斑試驗有良好的相關(guān)性。對于超純化的腺病毒，我們通過測定病毒顆粒的光密度（OD260）來換算為滴度（光密度與病毒的功效滴度有良好的相關(guān)性）。腺病毒具有相當(dāng)好的穩(wěn)定性。我們制備的腺病毒在室溫下保存多天仍具有活性。