基因敲入細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株

云舟生物的基因敲入穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞基因組靶位點(diǎn)的永久敲入。我們的基因敲入細(xì)胞采用CRISPR相關(guān)技術(shù)制備，需要針對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的靶位點(diǎn)導(dǎo)入一個(gè)特異性的gRNA/Cas9 RNP復(fù)合物，以及一個(gè)可通過(guò)HDR修復(fù)方式引入供體序列的供體載體。我們擁有一系列獨(dú)特的技術(shù)，可讓我們?cè)诤芏痰闹芷趦?nèi)實(shí)現(xiàn)具有高HDR率的高效基因遞送，高成功率獲得敲入純合子。

亮點(diǎn)：

超高整合效率：使用我們?cè)O(shè)計(jì)的供體載體和基因遞送方式，大部分靶細(xì)胞的HDR率可達(dá)到30-50%。
大片段敲入：可向多種類(lèi)型細(xì)胞插入長(zhǎng)達(dá)1 kb的DNA片段，包括ESC和iPSC。
周期短：載體設(shè)計(jì)完成后的單克隆敲入細(xì)胞從改造到交付，快至16周。

服務(wù)詳情

Workflow for gene overexpression stable cell line engineering

圖1 基因敲入穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建流程。

訂購(gòu)信息

服務(wù)	交付內(nèi)容	價(jià)格(CNY)	周期
基因敲入細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建（插入片段<3 kb）	一個(gè)單克隆細(xì)胞株（>10⁶個(gè)細(xì)胞/管, 2管）	￥40,980起	14-20周
基因敲入細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建（插入片段<3 kb）	兩個(gè)單克隆細(xì)胞株（>10⁶個(gè)細(xì)胞/管, 每個(gè)克隆各2管）	請(qǐng)咨詢(xún)
基因敲入細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建（插入片段>3 kb）	一個(gè)單克隆細(xì)胞株（>10⁶個(gè)細(xì)胞/管, 2管）	￥67,980起	16-24周
基因敲入細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建（插入片段>3 kb）	兩個(gè)單克隆細(xì)胞株（>10⁶個(gè)細(xì)胞/管, 每個(gè)克隆各2管）	請(qǐng)咨詢(xún)

* 增加交付單克隆數(shù)將收取額外費(fèi)用。

QC試驗(yàn)

試驗(yàn)項(xiàng)目	方法
基因敲入驗(yàn)證（默認(rèn)）	基因型PCR、Sanger測(cè)序
表達(dá)測(cè)試（額外收費(fèi)）	RT-qPCR、WB、IF、FACS
脫靶效應(yīng)分析（額外收費(fèi)）	NGS、PCR、Sanger測(cè)序
染色體分析（額外收費(fèi)）	核型分析
無(wú)菌測(cè)試（默認(rèn)）	PCR檢測(cè)支原體、生物負(fù)荷檢測(cè)等

下游服務(wù)

對(duì)于您的細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，我們可以開(kāi)展多種類(lèi)型的表型分析和功能驗(yàn)證，保括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、細(xì)胞活力、細(xì)胞毒性等。

案例分析

Validation of CRISPR knockin iPSC cell line

圖2 CRISPR介導(dǎo)的iPSC基因敲入。通過(guò)電轉(zhuǎn)法向iPSC中導(dǎo)入Cas9/gRNA RNP復(fù)合物和供體載體，成功敲入U(xiǎn)BC驅(qū)動(dòng)表達(dá)的EGFP（2432 bp）。（A）Sanger測(cè)序確認(rèn)EGFP成功敲入靶位點(diǎn)。（B）基因型PCR分析四個(gè)敲入純合子的單克隆。野生型（WT）靶點(diǎn)的長(zhǎng)度為762 bp，敲入了EGFP的靶點(diǎn)的長(zhǎng)度為3194 bp。（C）顯微鏡下的成功敲入的細(xì)胞具有EGFP熒光。（D）核型分析結(jié)果。（E）EGFP敲入的iPSC中多能性標(biāo)記物（NANOG、OCT4和SOX2）的免疫熒光結(jié)果。

常見(jiàn)問(wèn)題解答

為什么基因敲入實(shí)驗(yàn)相對(duì)基因敲除更具挑戰(zhàn)性？▼

基因敲除依賴(lài)于非同源末端連接 (NHEJ) 介導(dǎo)的 CRISPR 引起的DNA雙鏈斷裂 (DSB) 修復(fù)，該機(jī)制容易出錯(cuò)，移碼或片段刪除（使用雙 gRNA 時(shí)）等突變會(huì)以一定頻率發(fā)生，導(dǎo)致目標(biāo)基因功能喪失。另一方面，基因敲入則依賴(lài)于同源定向修復(fù)（HDR）機(jī)制，可將供體片段精確插入靶位點(diǎn)，其效率比NHEJ低，且僅限用于分裂細(xì)胞。此外，HDR效率也因細(xì)胞類(lèi)型而異。因此，基因敲入在技術(shù)上比基因敲除更具挑戰(zhàn)性。

環(huán)裝質(zhì)粒DNA、線(xiàn)性dsDNA、單鏈寡核苷酸（ssODN），哪一種供體模板形式適合您？▼

選擇供體模板的首要考慮因素是您的模板大小。對(duì)于小片段插入（<10 kb）,ssODN通常是最佳的選擇，其HDR效率較高。對(duì)于大片段，可因情況選擇使用線(xiàn)性dsDNA（細(xì)胞毒性較高，HDR率高）或者環(huán)狀質(zhì)粒載體（細(xì)胞耐受性好，HDR率低）。

如何分離單克隆細(xì)胞株？▼

藥篩后獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)導(dǎo)的混合細(xì)胞群。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等工具確定細(xì)胞數(shù)量和濃度。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓笤?6孔板中培養(yǎng)，并使其濃度為<1 細(xì)胞/孔。單獨(dú)的細(xì)胞克隆將被分離并擴(kuò)增，對(duì)其進(jìn)行基因型鑒定。