我們設(shè)計和評估shRNA的規(guī)則與RNAi consortium（TRC）使用的規(guī)則類似。對于每個RefSeq轉(zhuǎn)錄本，我們會搜索出所有的21 mers作為候選靶位點。以下因素會降低干擾效率/特異性或影響克隆，含有這些特點的序列將會被排除。主要因素包括：含有≥4個連續(xù)相同堿基，含有≥7個G或C，GC含量<25％或> 60％以及序列的5'端含有AA堿基。如果靶點內(nèi)部含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，或是3'末端的GC含量較高，或是該靶點是已知的miRNA核心序列或是會打靶到其他基因，則該靶點的分值就會較低。若靶位點存在于一個基因的多個轉(zhuǎn)錄本，則該靶點的分值就會較高。 所有的干擾分值均≥0，平均數(shù)約為5，標(biāo)準(zhǔn)差約為5，95%的分值均≤15。若一個shRNA的干擾分值是15，則表示具有很高干擾效率且易于克隆；若干擾分值為0，則表示干擾效果較差或難以克隆。

為了確定哪種方法最適合您的實驗應(yīng)用，以下是您應(yīng)該考慮的一些事項。

基本原理

• 基因敲低載體

基因敲低載體表達shRNA抑制靶基因的mRNA，通過引發(fā)mRNA的切割抑制翻譯過程。shRNA敲低不改變靶基因的DNA序列。

• 基因敲除載體

CRISPR和TALEN都是通過指導(dǎo)核酸酶切割基因組中的特定靶位點來發(fā)揮作用。然后這些切割位點被細胞低效地修復(fù)，從而導(dǎo)致修復(fù)部位的永久性突變，比如產(chǎn)生基因的小片段插入或堿基缺失。這類突變的一部分會導(dǎo)致基因的閱讀框移碼、出現(xiàn)提前終止密碼子等，最終導(dǎo)致目的基因的功能喪失。如果同時靶向基因組中兩個相鄰緊密的切割位點（距離幾個kb），也可以導(dǎo)致其間區(qū)域的刪除。

效率

shRNA敲低永遠不會完全抑制靶基因的表達。即使對于最有效的shRNA，靶基因的一些殘留表達也會保留。相比之下，在一小部分經(jīng)過處理的細胞群中，CRISPR和TALEN可以產(chǎn)生永久性突變，這可能導(dǎo)致基因功能完全喪失。

一致性和均一性

shRNA載體通常在轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞時獲得較好的均一性，實驗之間的一致性也較佳。相比之下，由于引入突變是隨機的，CRISPR和TALEN的基因編輯效果在細胞之間的差異相當(dāng)大。為了完全敲除細胞中的目的基因，必須敲除細胞中基因的所有拷貝。鑒于正常細胞具有任何基因的兩個拷貝（X或Y連鎖基因除外），而癌細胞可以具有兩個以上的拷貝，這種完全敲除的細胞可能只占所有處理后的細胞的一小部分。出于這個原因，核酸酶介導(dǎo)的敲除實驗需要通過測序來篩選克隆，以確定所有目的基因拷貝都被敲除的子細胞群。

脫靶效應(yīng)

已有報道表明shRNA介導(dǎo)的基因敲低和核酸酶介導(dǎo)的基因敲除均會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)的表征可以通過使用多個不同的shRNA 靶向同一基因來評估。如果一個基因被在多個不同的shRNA作用下仍然表現(xiàn)出一致的表征，則這種表征通常則不是脫靶效應(yīng)帶來的。對于CRISPR或TALEN基因敲除，應(yīng)分析含有功能喪失突變的多個克隆，以包含可能由脫靶突變引起的任何表征。此外，可以對克隆進行脫靶位點測序，通過生物信息學(xué)方法鑒定以查看它們是否已發(fā)生突變。