細(xì)菌基因組編輯

細(xì)菌基因組編輯可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌生理或代謝特性的精確修飾與調(diào)控。從自定義基因組編輯策略到交付經(jīng)過(guò)序列確認(rèn)的菌株，云舟生物可提供全方位的細(xì)菌基因組編輯解決方案。我們具備在基因敲除、插入以及靶向突變等多種項(xiàng)目的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，可確保根據(jù)您的具體需求實(shí)現(xiàn)高效的細(xì)菌基因組編輯。

服務(wù)詳情

Typical workflow of genome engineering in bacteria

圖1. 細(xì)菌基因組編輯的典型流程

服務(wù)模塊	簡(jiǎn)述	價(jià)格（CNY）	周期
載體設(shè)計(jì)與克隆	云舟生物富有經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)家團(tuán)隊(duì)將為您優(yōu)化載體設(shè)計(jì)，將關(guān)鍵元件克隆至恰當(dāng)?shù)馁\|(zhì)粒骨架。	￥3,380起	2-3周
菌株評(píng)估	對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行一系列關(guān)鍵參數(shù)評(píng)估，包括生長(zhǎng)條件、轉(zhuǎn)化效率、序列驗(yàn)證以及與基因組編輯相關(guān)的其它因素。	免費(fèi)	1周
編輯菌株制備*	將質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)菌株細(xì)胞，隨后在特定條件下培養(yǎng)以促進(jìn)基因組編輯。含有所需修飾的細(xì)胞將進(jìn)一步進(jìn)行篩選和驗(yàn)證以確認(rèn)編輯效果。	￥20,000起	2-5周

*我們默認(rèn)以甘油菌形式交付基因編輯后的菌株。我們的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制（QC）包含PCR和Sanger測(cè)序項(xiàng)目。點(diǎn)此可咨詢(xún)額外的QC項(xiàng)目。

技術(shù)詳情

λ Red重組

λ Red重組系統(tǒng)是一種在細(xì)菌基因組編輯廣泛使用的工具。這一源自λ噬菌體的系統(tǒng)可顯著增強(qiáng)外源DNA片段與宿主基因組之間的同源重組效率。該系統(tǒng)由三個(gè)主要部分組成，它們協(xié)同作用促進(jìn)同源重組的發(fā)生（圖2）。

Key components of the Lambda Red recombineering system

圖2 λ Red重組系統(tǒng)的關(guān)鍵組分。Exo，一種5'至3’核酸外切酶，可切割雙鏈DNA（dsDNA）；Beta，一種單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合蛋白，促進(jìn)外源DNA片段與靶位點(diǎn)同源序列的退火配對(duì)；Gam，抑制宿主細(xì)胞的核酸酶，可阻止導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的外源DNA被降解。

λ Red基因通常在引入供體DNA之前就需要在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。一種表達(dá)方法是使用編碼該組分的質(zhì)粒，或者使用常用于基因組編輯的穩(wěn)定整合了λ Red基因的細(xì)菌菌株。含有遺傳修飾的供體DNA可以以線性雙鏈DNA（dsDNA）或單鏈DNA（ssDNA）的形式導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，而該供體序列模板通常含有篩選標(biāo)記（如抗生素抗性基因）。Red蛋白（Exo、Beta和Gam）能促進(jìn)供體DNA與靶序列之間的同源重組。重組完成后，一般采用藥篩結(jié)合菌落PCR的方法分離獲得成功編輯的細(xì)菌細(xì)胞。

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9是一種廣泛應(yīng)用于各類(lèi)生物（包括細(xì)菌）的基因組編輯工具。在許多細(xì)菌物種（如大腸桿菌）中，由于非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)途徑的效率低下，CRISPR誘導(dǎo)的雙鏈斷裂（DSB）將具有致死性。這一特性使CRISPR無(wú)需額外篩選標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)強(qiáng)效的反向篩選。

基于CRISPR系統(tǒng)的細(xì)菌基因組編輯的所需組分一般包含Cas9蛋白、向?qū)NA（gRNA）以及供體DNA。為提高編輯效率，通常會(huì)共表達(dá)重組酶（如λ-Red系統(tǒng)的組分）以促進(jìn)同源重組的發(fā)生。

CRISPR組件的基因遞送可通過(guò)多種策略實(shí)現(xiàn)。圖3展示了這樣一種方案：Cas9與λ Red重組系統(tǒng)的蛋白使用單個(gè)質(zhì)粒共表達(dá)，而gRNA使用第二個(gè)質(zhì)粒表達(dá)。

Schematic representation of gene replacement utilizing the CRISPR-Cas9 system

圖3 利用CRISPR基因編輯在細(xì)菌中創(chuàng)建點(diǎn)突變的模式圖。編碼Cas9和重組酶的質(zhì)粒首先被導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，然后誘導(dǎo)λ Red蛋白的表達(dá)。隨后將表達(dá)gRNA的質(zhì)粒以及供體DNA導(dǎo)入表達(dá)有Cas9和重組酶的細(xì)胞。如果同源重組失敗，則由Cas9引發(fā)的DSB將導(dǎo)致細(xì)胞死亡（右）。相對(duì)地，只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生了供體DNA和基因組靶序列之間的同源重組時(shí)，細(xì)胞才能存活，從而實(shí)現(xiàn)所需的基因修飾（左）。

自殺質(zhì)粒

自殺質(zhì)粒攜帶了包含所需編輯的同源序列，并被設(shè)計(jì)為僅在允許宿主中或在特定條件下才能復(fù)制。該特性一般可通過(guò)以下機(jī)制實(shí)現(xiàn)：使用反向篩選標(biāo)記（比如賦予蔗糖敏感性的sacB基因）以及使用條件性復(fù)制系統(tǒng)（比如溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)）。在允許條件下將質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)菌后，整個(gè)質(zhì)粒通過(guò)單次同源重組事件即可整合至宿主基因組。當(dāng)環(huán)境轉(zhuǎn)換為非允許條件時(shí)，未整合的質(zhì)粒因無(wú)法復(fù)制而丟失（圖4）。隨后發(fā)生的第二次同源重組事件將質(zhì)粒的骨架序列從基因組中去除，而此時(shí)可通過(guò)PCR篩選獲得攜帶所需編輯的細(xì)胞。盡管該技術(shù)原理簡(jiǎn)單，但自殺質(zhì)粒需要較長(zhǎng)的同源臂，且存在較高假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)，因此通常需要進(jìn)行多輪篩選。

Schematic representation of gene knockin using suicide plasmids with a temperature-sensitive origin of replication

圖4 使用包含溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的自殺質(zhì)粒進(jìn)行基因敲入的模式圖。目的基因（GOI）以及篩選標(biāo)記通過(guò)同源重組整合至基因組靶位點(diǎn)。通過(guò)抗生素篩選出的克隆進(jìn)一步在非允許溫度下培養(yǎng)，避免質(zhì)粒復(fù)制。第二次重組事件發(fā)生將產(chǎn)生包含穩(wěn)定整合或者基因組回退至野生型的兩種克隆。對(duì)發(fā)生了敲入的克隆進(jìn)一步篩選并使用PCR確認(rèn)基因敲入。

案例研究

CRISPR-Cas9 mediated gene editing in E. coli

圖5 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的E. coli基因組編輯。（A）通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)λ Red蛋白以及同時(shí)使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除E. coli的基因組片段。（B）在未經(jīng)編輯的細(xì)胞中（泳道1），對(duì)靶區(qū)域PCR擴(kuò)增獲得了符合預(yù)期的約3900 bp大小的擴(kuò)增子，而對(duì)于經(jīng)過(guò)CRISPR基因敲除的細(xì)胞（泳道2），其擴(kuò)增子大小只有約1800 bp，表明約有2100 bp的片段被敲除了。

客戶(hù)提供材料

如需客戶(hù)提供材料，請(qǐng)聯(lián)系我們了解外來(lái)物品接收指南。請(qǐng)嚴(yán)格按照我們的指南來(lái)進(jìn)行裝運(yùn)以免造成物品的任何延誤和損壞?？蛻?hù)提供的所有材料均需經(jīng)過(guò)QC檢測(cè)，每一份材料附加檢測(cè)費(fèi)用。請(qǐng)注意，客戶(hù)提供物品接收并通過(guò)QC之后生產(chǎn)才正式開(kāi)始。

常見(jiàn)問(wèn)題解答

不同的細(xì)菌基因組編輯方法之間有何優(yōu)劣比較？▼

每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，具體總結(jié)如下。通常需要結(jié)合多種方法，才能實(shí)現(xiàn)理想的編輯效果。其中，基于CRISPR的技術(shù)具有高效性和靈活性，因此編輯效果尤為顯著。

方法	描述	優(yōu)勢(shì)	不足
CRISPR/Cas9	在供體DNA存在的情況下，gRNA引導(dǎo)的Cas9誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，通過(guò)同源重組修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)目標(biāo)編輯。	反向篩選方式：未經(jīng)編輯的細(xì)胞會(huì)被DSB誘導(dǎo)細(xì)胞死亡同時(shí)適用于大范圍和小范圍的基因組編輯	潛在的脫靶效應(yīng) 需要PAM位點(diǎn)
λ Red重組	源自λ噬菌體，利用Exo、Beta和Gam蛋白實(shí)現(xiàn)高重組效率。	對(duì)多種編輯類(lèi)型十分有效只需要很短的同源序列區(qū)域（40-50 bp）用于同源重組	可能需要專(zhuān)門(mén)的菌株用于控制重組酶的表達(dá) 可能需要使用反向篩選的方式去除抗生素篩選標(biāo)記
自殺質(zhì)粒	質(zhì)粒被設(shè)計(jì)為在一種宿主/條件下復(fù)制，而在另一種宿主/條件下不復(fù)制。	不需要特定的菌株對(duì)于基因組序列的大規(guī)模刪除或者對(duì)靶基因功能的破壞十分有效	不太高效的編輯效率假陽(yáng)性頻率高需要較長(zhǎng)的同源臂