輔助病毒

利用RABV進行神經(jīng)示蹤需要同時轉導表達RABV G蛋白的輔助病毒。對于轉導EnvA糖蛋白假型化的RABV，利用輔助病毒在靶細胞表達TVA是必要的。關于這些輔助病毒的信息如下。

運輸與存儲

我們的RABV病毒保存于HBSS緩沖液，并以干冰形式運輸。接收到病毒后，RABV可以在-80°C長期存儲（可至少穩(wěn)定存儲6個月），或者在-20°C存儲一周。RABV的保質期約為1年。請避免反復凍融RABV以避免顯著的滴度下降。

RABV制備與質量控制

RABV包裝流程如圖2所示。攜帶GOI的轉移質粒、分別攜帶RABV G、N、P、L基因的包裝質粒、以及一個表達T7 RNA聚合酶的質粒一同轉染包裝細胞。包裝質粒表達的病毒蛋白對于含有目的基因的病毒顆粒組裝是必須的。制備覆蓋有G糖蛋白的RABV后，收集細胞上清，再次感染包裝細胞。此時若同時轉染一個表達異源包膜蛋白的質粒（比如表達EnvA），則可以獲得假型化的RABV病毒。對于非純化的RABV病毒（體外應用級別），使用超速離心法濃縮純化。對于超純化的RABV病毒（體內應用級別），使用蔗糖密度梯度離心法濃縮純化。我們使用噬斑法檢測滴度。

圖2 典型的RABV包裝流程。

對于每一個生產(chǎn)的重組RABV病毒，質量控制包括滴度檢測、無菌測試、支原體檢測等。如果RABV病毒載體表達熒光蛋白，則我們會進行熒光轉導測試。如果RABV病毒載體含有藥篩標記，我們也會在轉導測試后伴隨進行藥篩測試。此外，對于超純化RABV，我們會進行內毒素檢測。

試驗驗證

1. 單突觸示蹤
2. 體外轉導測試

RABV背景知識

RABV是一種負鏈RNA病毒，屬于彈狀病毒科。RABV基因組長度約為12 kb，可以插入3-5 kb的轉基因片段。該病毒使用G糖蛋白來識別通常在神經(jīng)元軸突末端發(fā)現(xiàn)的各種受體。野生型RABV一旦進入軸突末端，病毒就會逆行傳輸?shù)郊毎w，并在那里進行復制。RABV的病毒復制和轉錄均發(fā)生在細胞質中，最大限度地減少了整合宿主基因組的風險，且降低了病毒生命周期對宿主機制的依賴。

復制后的病毒被隨后運輸?shù)缴窠?jīng)元樹突，并以出芽方式釋放。這種高度嗜神經(jīng)性的病毒僅能通過化學突觸傳播到其他細胞，感染新的軸突末端，并經(jīng)由外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)繼續(xù)傳播到突觸前神經(jīng)元。

RABV載體的主要應用

神經(jīng)網(wǎng)絡展示

重組RABV主要用于神經(jīng)網(wǎng)絡的突觸追蹤（圖5）。RABV有著逆行傳輸以及跨突觸傳播的限制，因此可實現(xiàn)對神經(jīng)連接的特定可視化和調控。RABV載體通常缺失G糖蛋白基因，因此病毒在感染一級神經(jīng)元后無法傳播至其它細胞。 然而，當病毒被引入具有G糖蛋白表達的細胞時（比如通過AAV轉導引入），可產(chǎn)生的功能性病毒，然后傳播且只能傳播至上游二級神經(jīng)元，實現(xiàn)單突觸追蹤。

特定神經(jīng)元中的單突觸連接研究也是一種常見的實驗需求。使用EnvA/TVA系統(tǒng)將允許病毒靶向特定神經(jīng)元：整合了EnvA包膜蛋白的假型化RABV特異性感染同時表達TVA受體以及G糖蛋白的一級神經(jīng)元。這將確保只有靶細胞被重組RABV感染，并允許對所有直接輸入進行單突觸追蹤。

圖5 重組RABV的生產(chǎn)、轉導和感染。

疫苗制備

狂犬病是一種出現(xiàn)癥狀后致死率接近100%的疾病，其疫苗的開發(fā)也是一個熱點問題。目前滅活RABV是最常用的疫苗載體形式，但是具備自我復制能力的重組RABV疫苗載體也在被進一步研究。 HEP-Flury毒株因其高度減毒、低致病性和較強的免疫原性而特別適合于該種應用。

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文檔

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