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• CRISPRi（CRISPR interference）慢病毒套裝包含2種病毒：gRNA慢病毒和dCas9-Silencer2慢病毒。1個gRNA慢病毒同時攜帶gRNA表達(dá)盒子和Puromycin抗性基因。1個dCas9-Silencer2慢病毒同時攜帶dCas9-Silencer2表達(dá)盒子和Hygromycin抗性基因。病毒感染細(xì)胞后，病毒基因組整合到細(xì)胞基因組中，隨細(xì)胞分裂而復(fù)制，實現(xiàn)外源基因長期穩(wěn)定表達(dá)。gRNA和dCas9-Silencer2融合蛋白需同時存在，CRISPRi才能工作。使用Puromycin和Hygromycin兩種抗生素篩選出成功感染2種病毒的細(xì)胞進(jìn)行下游實驗。
• dCas9（dead Cas9）是Cas9的突變體，缺失了核酸內(nèi)切酶的能力。一旦表達(dá)，dCas9蛋白和gRNA將形成一個核糖核蛋白復(fù)合物（Ribonucleoprotein complex）。dCas9-gRNA復(fù)合體將任意地結(jié)合細(xì)胞基因組上的PAM序列（SpCas9的PAM序列為5'-NGG-3'），但只有g(shù)RNA分子的5‘引導(dǎo)序列（Guide sequence，約20 bp）與細(xì)胞基因組DNA配對時，dCas9才會充分解開靶序列的上下鏈，gRNA進(jìn)一步與靶序列的其中一條鏈完全互補(bǔ)結(jié)合，此時，dCas9-gRNA復(fù)合體穩(wěn)定地結(jié)合到靶序列上。CRISPRi系統(tǒng)中，一般將gRNA設(shè)計為靶向一個基因的TSS（transcription start site）位置（-50到+300區(qū)域為佳）。在此位置，dCas9-gRNA復(fù)合體本身就能物理性地阻礙RNA聚合酶的作用，從而影響基因的表達(dá)。dCas9-Silencer2是一個dCas9融合了KRAB等轉(zhuǎn)錄抑制子的融合蛋白。KRAB等轉(zhuǎn)錄抑制子能進(jìn)一步抑制基因的表達(dá)。Silencer2版本的轉(zhuǎn)錄抑制子，在KRAB的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，抑制效率更高。
• 多條gRNA作用一個基因的TSS區(qū)域，抑制效果更佳。

RNAi存在2類脫靶：序列相關(guān)性和非序列相關(guān)性

序列相關(guān)性脫靶：
僅憑有限的部分堿基互補(bǔ)，siRNA就能引起非目標(biāo)mRNA的沉默。
取決于siRNA序列，?個siRNA可能抑制成百上千條轉(zhuǎn)錄本。

非序列相關(guān)性脫靶：
shRNA采?內(nèi)源miRNA通路實現(xiàn)基因敲除。當(dāng)?量shRNA導(dǎo)?細(xì)胞后，它們使RNAi系統(tǒng)達(dá)到飽和，并與內(nèi)源miRNA競爭蛋白，例如Dicer、RISC和其它因子。由此，那些內(nèi)源miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控受到干擾，導(dǎo)致不可以預(yù)期的脫靶。