在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物中，該常規(guī)質(zhì)粒FLEX（Flip-Excision）條件性基因表達(dá)載體系統(tǒng)Cre-off，通過(guò)Cre重組酶條件性失活目的基因的表達(dá)。FLEX Cre-off系統(tǒng)利用位于目的基因兩側(cè)的Lox-變體重組位點(diǎn)，在Cre重組酶的調(diào)控下目的基因發(fā)生反轉(zhuǎn)，目的基因不能正常表達(dá)；而Cre不存在的情況下，目的基因則正常表達(dá)。

FLEX Cre-off系統(tǒng)由兩對(duì)異型Lox-變體重組位點(diǎn)組成，其中野生型序列稱(chēng)為L(zhǎng)oxP，突變體稱(chēng)為L(zhǎng)ox2272，分別位于ORF的兩側(cè)。 兩種Lox-變體都可被Cre識(shí)別，但只有相同的Lox位點(diǎn)對(duì)可以彼此重組，與其他Lox-變體不能進(jìn)行重組。 LoxP和Lox2272位點(diǎn)以交替方式位于ORF兩端，每對(duì)位點(diǎn)互為反向。Cre重組酶不存在的情況下，客戶(hù)定制的啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)目的基因的正常表達(dá)。Cre重組酶存在的情況下，LoxP和Lox2272位點(diǎn)對(duì)分別重組，導(dǎo)致ORF方向反轉(zhuǎn)為反向，且其中的一對(duì)重組位點(diǎn)將具有相同的方向，Cre會(huì)介導(dǎo)產(chǎn)生正向重組切割，繼而分別留下一個(gè)不同的重組位點(diǎn)。ORF方向的反轉(zhuǎn)，使得目的基因無(wú)法正常表達(dá)。由于ORF側(cè)翼是兩個(gè)不同的Lox-變體位點(diǎn)，所以即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組。

雖然該載體系統(tǒng)可用于組織培養(yǎng)細(xì)胞，但它更適用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 當(dāng)攜帶這種載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與攜帶組織特異性Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交時(shí)，在攜帶兩種載體的后代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，特別是在表達(dá)組織特異性Cre的細(xì)胞中，目的基因的表達(dá)將會(huì)失活。

抗性篩選或熒光基因可以添加到該載體中，以便于通過(guò)藥篩或者熒光篩選出永久整合外源基因的細(xì)胞。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

該載體用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物中，Cre介導(dǎo)的條件性基因表達(dá)。目的基因最初處于正常表達(dá)狀態(tài)，通過(guò)Cre重組酶的共表達(dá)后目的基因編碼方向發(fā)生反轉(zhuǎn)而實(shí)現(xiàn)永久失活。

基因失活可控：Cre重組酶存在的情況下，ORF方向轉(zhuǎn)為反向，可防止基因發(fā)生泄漏表達(dá)。

基因穩(wěn)定失活： 在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點(diǎn)對(duì)分別重組，導(dǎo)致ORF方向永久性地轉(zhuǎn)為反向，且其中的一對(duì)重組位點(diǎn)將具有相同的方向，Cre會(huì)介導(dǎo)產(chǎn)生正向重組切割，繼而在ORF的兩端留下兩個(gè)不同的Lox-變體，即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組，使得目的基因的表達(dá)永久失活。

技術(shù)簡(jiǎn)單：常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過(guò)程更簡(jiǎn)單。

載體容量非常大：我們的載體總?cè)萘靠蛇_(dá)30 kb，其中質(zhì)粒骨架只占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶(hù)所感興趣的序列。

高水平表達(dá)：常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞多達(dá)幾千拷貝），使外源基因能高水平表達(dá)。

適用于動(dòng)物體內(nèi)研究：雖然該載體系統(tǒng)可用于組織培養(yǎng)細(xì)胞，但它更適用于制備Cre介導(dǎo)的條件性基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

載體DNA非整合型：常規(guī)質(zhì)粒在細(xì)胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染也稱(chēng)為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。然而，質(zhì)粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染每102~106個(gè)細(xì)胞可能會(huì)有一個(gè)細(xì)胞的基因組被整合，整合效率取決于細(xì)胞類(lèi)型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標(biāo)記基因的載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，在經(jīng)過(guò)擴(kuò)大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細(xì)胞分選來(lái)獲得穩(wěn)定整合了該載體的細(xì)胞。

可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型受限：不同類(lèi)型細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異很大。非分裂細(xì)胞比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞系更難轉(zhuǎn)染。一些重要的細(xì)胞類(lèi)型更是難以轉(zhuǎn)染，如神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，很少運(yùn)用到活體實(shí)驗(yàn)。

基因拷貝數(shù)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個(gè)細(xì)胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細(xì)胞間卻有高度的差異性。在一些細(xì)胞中，質(zhì)?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細(xì)胞卻是低拷貝甚至沒(méi)有。而病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)更傾向于相對(duì)均勻地把基因轉(zhuǎn)到細(xì)胞中。

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Lox2272: Recombination site for Cre recombinase. Mutated Lox site with two base substitutions of wild type LoxP. Incompatible with LoxP sites. When Cre is present, the LoxP and LoxP2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. Incompatible with Lox2272 sites. When Cre is present, the LoxP and Lox2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here, in a sense orientation.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.