FLEX介導(dǎo)條件性表達(dá)腺病毒載體結(jié)合了載體家的高效的腺病毒載體系統(tǒng)和Cre響應(yīng)的FLEX條件性基因表達(dá)載體，可以幫助您實(shí)現(xiàn)在多種多樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Cre響應(yīng)的FLEX基因表達(dá)調(diào)控開(kāi)關(guān)。FLEX Cre-On系統(tǒng)利用位于目的基因兩側(cè)的Lox-變體重組位點(diǎn)，在Cre重組酶的調(diào)控下目的基因發(fā)生反轉(zhuǎn)，目的基因正常表達(dá)；而Cre不存在的情況下，目的基因不表達(dá)。

FLEX Cre-On系統(tǒng)由兩對(duì)異型Lox-變體重組位點(diǎn)組成，其中野生型序列稱為L(zhǎng)oxP，突變體稱為L(zhǎng)ox2272，分別位于反向基因ORF（相對(duì)啟動(dòng)子方向而言）的兩側(cè)。 兩種Lox-變體都可被Cre識(shí)別，但只有相同的Lox位點(diǎn)對(duì)可以彼此重組，與其他Lox-變體不能進(jìn)行重組。 LoxP和Lox2272位點(diǎn)以交替方式位于ORF兩端，每對(duì)位點(diǎn)互為反向。Cre重組酶不存在的情況時(shí)，目的基因由于其編碼方向與啟動(dòng)子方向相反，所以不發(fā)生表達(dá)；在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點(diǎn)對(duì)分別重組，導(dǎo)致ORF方向反轉(zhuǎn)為正向，且其中的一對(duì)重組位點(diǎn)將具有相同的方向，Cre會(huì)介導(dǎo)產(chǎn)生正向重組切割，繼而分別留下一個(gè)不同的重組位點(diǎn)。 ORF的方向反轉(zhuǎn)，使得目的基因可以在啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下正常表達(dá)。由于ORF側(cè)翼是兩個(gè)不同的Lox-變體位點(diǎn)，所以即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組。

腺病毒載體首先是以質(zhì)粒的方式構(gòu)建并使用E. coli擴(kuò)增，然后線性化后轉(zhuǎn)染進(jìn)入包裝細(xì)胞。在包裝過(guò)程中，位于兩個(gè)反向重復(fù)序列（ITR）之間的DNA片段與由包裝細(xì)胞表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)一步包裝成病毒顆粒。對(duì)于上述的FLEX介導(dǎo)的Cre-On條件性表達(dá)腺病毒載體，F(xiàn)LEX Cre-On開(kāi)關(guān)位于兩個(gè)ITR之間。當(dāng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞時(shí)，載體并以游離DNA的形式存在于細(xì)胞核中。

通過(guò)改造優(yōu)化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區(qū)，前兩者與病毒包裝相關(guān)（這兩個(gè)基因已被整合到包裝細(xì)胞的基因組中）。因此，運(yùn)用我們的病毒載體包裝出來(lái)的病毒是復(fù)制缺陷型的（只能轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞而不能自我復(fù)制），大大提高了生物安全性。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

FLEX Cre-On條件性表達(dá)腺病毒載體專(zhuān)為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效的條件性基因激活表達(dá)而設(shè)計(jì)。目的基因剛開(kāi)始時(shí)為默認(rèn)不表達(dá)，但是在Cre重組酶共表達(dá)的情況下將被激活表達(dá)，并且將反轉(zhuǎn)和改變目的基因的編碼方向。Cre存在的情況下，目的基因的表達(dá)受用戶自定義的啟動(dòng)子的調(diào)控。

該載體由血清型5（Ad5）腺病毒衍生而來(lái)。經(jīng)優(yōu)化，該載體系統(tǒng)在大腸桿菌體內(nèi)具有很高的拷貝數(shù)，包裝的活病毒具有很高的滴度，對(duì)大多數(shù)宿主細(xì)胞具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，能有效地把載體整合到靶細(xì)胞基因組并實(shí)現(xiàn)外源基因的高水平表達(dá)。

基因激活可控：目的基因ORF的反向放置，可防止基因發(fā)生泄漏表達(dá)。而某些條件性基因表達(dá)系統(tǒng)，如LoxP-Stop-LoxP表達(dá)載體系統(tǒng)，在某些情況下可能會(huì)有一些低水平的漏表達(dá)。

基因穩(wěn)定激活：在Cre的存在下，LoxP和Lox2272位點(diǎn)對(duì)分別重組，導(dǎo)致ORF方向永久性地反轉(zhuǎn)為正向，且其中的一對(duì)重組位點(diǎn)將具有相同的方向，Cre會(huì)介導(dǎo)產(chǎn)生正向重組切割，繼而在ORF的兩端留下兩個(gè)不同的Lox-變體，即使存在Cre也不會(huì)進(jìn)一步發(fā)生重組，使得目的基因可以在客戶定制的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下正常表達(dá)。

對(duì)宿主基因組造成破壞的低風(fēng)險(xiǎn)性：在轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞后，腺病毒載體在細(xì)胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風(fēng)險(xiǎn)，使其成為人類(lèi)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的理想載體。

超高病毒滴度：腺病毒可通過(guò)再次轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞而得到大量擴(kuò)增，從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和AAV載體都不具有這個(gè)特性。我們提供的腺病毒滴度可以達(dá)到>10¹² VP/ml。

載體容量非常大：腺病毒能有效包裝的基因組上限大小是~38.7 kb（從5' ITR到3' ITR）。在除去腺病毒包裝表達(dá)所需主要元件所占用的容量之后，我們的載體具有約~7.5 kb的裝載空間以容納目的DNA（例如啟動(dòng)子，ORF和熒光標(biāo)記）。相比起容量為6.4 kb的慢病毒表達(dá)載體，腺病毒載體容量更大，能滿絕大多數(shù)應(yīng)用要求。

宿主范圍廣泛：來(lái)源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞都能被腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，但某些細(xì)胞類(lèi)型則比較難轉(zhuǎn)導(dǎo)（見(jiàn)下文不足之處）。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均有效：我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還具有體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

安全性高：為了確保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失了病毒包裝所必須的基因（這些基因被整合到包裝細(xì)胞的基因組）。 所以，利用我們的腺病毒載體包裝出來(lái)的病毒是復(fù)制缺陷型的，并且只有在包裝細(xì)胞中才具有復(fù)制能力。

載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會(huì)整合到靶細(xì)胞的基因組中，而是以游離DNA的形式存在，并且隨著時(shí)間推移逐漸丟失，特別是在分裂細(xì)胞中。

難以轉(zhuǎn)導(dǎo)特定類(lèi)型的細(xì)胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多類(lèi)型的細(xì)胞包括非分裂細(xì)胞，但對(duì)某些特定類(lèi)型的細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、呼吸上皮分化細(xì)胞、外周血細(xì)胞、神經(jīng)元和造血干細(xì)胞等，卻無(wú)法進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

較強(qiáng)的免疫原性：活腺病毒會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而限制了其在體內(nèi)的某些應(yīng)用。

技術(shù)復(fù)雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生活病毒，然后測(cè)定病毒滴度。這些過(guò)程技術(shù)難度更高，周期更長(zhǎng)。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Lox2272: Recombination site for Cre recombinase. Mutated Lox site with two base substitutions of wild type LoxP. Incompatible with LoxP sites. When Cre is present, the LoxP and LoxP2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

LoxP: Recombination site for Cre recombinase. Incompatible with Lox2272 sites. When Cre is present, the LoxP and Lox2272 sites will be cut and recombine with compatible sites.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here, in a sense orientation.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.