果蠅基因表達雙整合系統(tǒng)載體pUASTB

概述

我們的pUASTB載體系統(tǒng)是一個高效的轉(zhuǎn)基因果蠅制備和基因表達控制系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠利用果蠅P元件轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（如pUAST）或噬菌體φC31整合系統(tǒng)（如pUASTattB）并結(jié)合強誘導型啟動子Gal4調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的表達。因此，pUASTB載體系統(tǒng)可用于P轉(zhuǎn)座子和φC31整合酶介導目的基因插入。目的基因會被克隆到pUASTB兩個P-元件末端重復序列中間和attB重組位點附近的區(qū)域。

為了實現(xiàn)P轉(zhuǎn)座子介導的插入，將pUASTB質(zhì)粒和表達P轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒共同導入宿主細胞或胚胎中。接著，由輔助質(zhì)粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶識別pUASTB質(zhì)粒上的兩個P元件末端重復序列，并將包含兩個P元件末端重復之間的序列插入宿主基因組中。

為了實現(xiàn)φC31整合酶介導的插入，將pUASTB質(zhì)粒和表達φC31整合酶的輔助質(zhì)粒共同導入宿主細胞或含有attP位點的胚胎中。φC31整合酶介導attB和attP位點之間的不可逆重組，導致pUASTB載體線性化并整合到宿主基因組中。

mini white基因的表達，可以使果蠅的眼色發(fā)生變化，是鑒定轉(zhuǎn)基因果蠅成功與否的標記。

在pUASTB系統(tǒng)中，目的基因?qū)⒈豢寺〉胶铣烧T導型啟動子的下游，該啟動子由5個串聯(lián)排列的GAL4結(jié)合位點（5xUAS）和hsp70 TATA box組成。目的基因依賴于GAL4的表達，GAL4蛋白在與pUAST質(zhì)粒上的UAS位點結(jié)合后會激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。因此，在沒有GAL4表達的情況下，目的基因保持沉默，但是通過與表達GAL4的果蠅系雜交后，在GAL4表達的細胞中，目的基因會被轉(zhuǎn)錄激活。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Development. 118:401 (1993)	Development and use of the pUAST inducible promoter system
Methods Mol Biol. 420:61 (2008)	The use of P-element transposons to generate transgenic flies
Proc Natl Acad Sci U S A. 97:5995 (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 95:5505 (1998)	Description of the φC31 integrase system
Proc Natl Acad Sci U S A. 104:3312 (2007)	Use of pUASTattB and germ-line-specific φC31 integrase to construct transgenic Drosophila
Genetics. 166:1775 (2004)	Use of pUASTB to construct transgenic Drosophila

亮點

我們的pUAST果蠅基因表達載體可有效實現(xiàn)P轉(zhuǎn)座酶或φC31整合酶介導的基因插入或目的基因GAL4依賴性表達。我們的載體在大腸桿菌中具有高拷貝，可用于高效產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因果蠅。

優(yōu)勢

特定位點插入：基于φC31的插入具有位點特異性，通常僅發(fā)生在attP位點，降低了破壞內(nèi)源基因或插入位點不當影響轉(zhuǎn)基因表達的風險。

高水平表達：5×UAS/mini_Hsp70啟動子可以在誘導狀態(tài)下使目的基因高水平表達。

選擇性表達: 不存在GAL4的情況下，目的基因的轉(zhuǎn)錄水平很低或沒有；在GAL4的存在下，則能實現(xiàn)高水平的基因轉(zhuǎn)錄。

高效：使用φC31整合酶實現(xiàn)種系轉(zhuǎn)基因比基于P元件的載體系統(tǒng)如pUAST更有效。

不足之處

基因組隨機插入：p元件的隨機整合，使得插入位點難以定位，基因組位置也有可能影響轉(zhuǎn)基因的表達。此外，轉(zhuǎn)基因插入到基因或基因組內(nèi)的調(diào)控元件可能影響內(nèi)源基因。

潛在的泄漏表達：在某些情況下，即使沒有GAL4，目的基因也會發(fā)生低水平泄漏表達。

技術(shù)復雜：轉(zhuǎn)基因果蠅的產(chǎn)生需要胚胎注射和飛行飼養(yǎng)，具有一定的技術(shù)復雜性。

需要attP插入位點：使用pUASTattB載體系統(tǒng)制備轉(zhuǎn)基因果蠅，需要使用基因組中攜帶attP“著陸位點”的特異宿主。

載體關(guān)鍵元件

P-element 3’ end: Right terminal repeat, or 3' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

5×UAS/mini_Hsp70: The Drosophila melanogaster heat shock protein 70 (Hsp70) minimal promoter fused with five tandem galactose upstream activating sequences (5×UAS). This is a strong promoter, tightly inducible by GAL4.

Kozak: Drosophila Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 terminator: Simian virus 40 transcriptional terminator. Contains the SV40 small T intron and the SV40 early polyadenylation signal.

attB site: The bacterial attachment site, attB, recognized by the bacteriophage φC31 serine integrase. φC31 integrase can catalyze site-specific integration of attB-containing plasmids into attP-containing docking or landing sites that have been introduced into host genomes.

mini-white: A variant of the Drosophila white gene. The mini-white gene is a dominant marker for adult fruit fly eye color, which can be used as a reporter to identify transgenic events in a white mutant background.

P-element 5’ end: Left terminal repeat, or 5' terminal repeat, of the P element. When a DNA sequence is flanked by the 3’ and 5’ P-element terminal repeats, the P transposase can recognize them and insert the flanked region into the host genome.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

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