水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）載體在研究病毒顆粒入侵宿主細(xì)胞、辨認(rèn)介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞表面受體、篩選病毒抑制藥物以及疫苗開發(fā)方面有著廣泛的應(yīng)用。VSV病毒載體可以高效地利用異源病毒的包膜蛋白進(jìn)行假型化（Presudotypted），比如那些需要在高生物安全等級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作的病毒的包膜蛋白。重組VSV在宿主細(xì)胞中不能進(jìn)行超過(guò)一輪的復(fù)制，因此可以在生物安全2級(jí)（BSL2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)操作。這些特點(diǎn)促使VSV病毒載體成為在無(wú)需高度隔離下研究高風(fēng)險(xiǎn)病毒侵入細(xì)胞機(jī)制的理想選擇。

野生型VSV屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae），擁有一條單鏈負(fù)義RNA基因組，并且其復(fù)制依賴病毒的RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。VSV的單鏈RNA基因組編碼以下五種蛋白組分：核蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和病毒RdRp的大亞基（L）。VSV病毒顆粒中，其RNA基因組與N核蛋白組成核糖核酸蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）。P和L蛋白則組成RdRp，并結(jié)合于RNP。VSV感染靶細(xì)胞時(shí)，其G糖蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞作用，幫助病毒侵入細(xì)胞。G糖蛋白可以介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合，促使RNP和RdRp一起釋放到細(xì)胞質(zhì)中。病毒組分進(jìn)入細(xì)胞后，RdRp以RNP中的負(fù)義RNA基因組為模板立即啟動(dòng)一級(jí)轉(zhuǎn)錄，而作為轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正義RNA鏈被進(jìn)一步翻譯，用于生產(chǎn)介導(dǎo)病毒基因組復(fù)制、二級(jí)轉(zhuǎn)錄、病毒組裝和出芽等病毒等功能的后期蛋白。

載體家生產(chǎn)的重組VSV是G糖蛋白基因缺失的，該缺失導(dǎo)致VSV自我復(fù)制缺陷的。G糖蛋白基因通常被替換為報(bào)告基因（如熒光蛋白基因、熒光素酶報(bào)告基因或分泌型堿性磷酸酶基因）用于病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果測(cè)定。生產(chǎn)VSV假病毒主要由三個(gè)步驟構(gòu)成：1. 使用質(zhì)粒初步制備VSV；2. 擴(kuò)增G糖蛋白補(bǔ)全的VSV；3. 使用異源病毒的包膜蛋白組裝VSV假病毒。進(jìn)行重組VSV初步制備時(shí)，首先利用大腸桿菌構(gòu)建一個(gè)可轉(zhuǎn)錄編碼VSV基因組的負(fù)義RNA鏈的VSV-ΔG轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為RdRp合成病毒RNA的RNA模板。該載體與四個(gè)輔助載體（分別表達(dá)VSV N、P、G和L蛋白）共轉(zhuǎn)染至經(jīng)牛痘病毒接種的表達(dá)噬菌體T7 RNA聚合酶的包裝細(xì)胞。T7 RNA聚合酶作用于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上的T7啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)VSV-ΔG基因組轉(zhuǎn)錄出負(fù)義RNA。重組VSV在包裝細(xì)胞中組裝并釋放。收集細(xì)胞上清，用其再次感染表達(dá)有G糖蛋白的包裝細(xì)胞，獲得高產(chǎn)量的G糖蛋白補(bǔ)全的重組VSV。VSV假病毒隨后通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)G糖蛋白補(bǔ)全的VSV至表達(dá)有異源病毒包膜蛋白的包裝細(xì)胞的方式制備。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的VSV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒刪除了VSV的G糖蛋白基因，因此可通過(guò)提供異源病毒包膜糖蛋白的順式元件來(lái)組裝VSV假病毒。VSV病毒的細(xì)胞嗜性取決于其包膜蛋白的類型。經(jīng)過(guò)專門優(yōu)化，我們的VSV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒可以在大腸桿菌中以高拷貝數(shù)方式復(fù)制，并含有報(bào)告基因以用于VSV假病毒感染靶細(xì)胞后的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果測(cè)定。

病毒滴度高：我們的VSV載體可用于包裝滴度高達(dá)>10⁸ PFU/ml 的VSV病毒。該滴度范圍的VSV病毒感染體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，足量病毒可以獲得100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

生產(chǎn)上易于擴(kuò)增：重組VSV可以很方便地幾乎在所有類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增制備。

安全性高：重組VSV只能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行一輪復(fù)制。使用VSV假病毒可以安全地在BSL-2設(shè)施中研究高風(fēng)險(xiǎn)病毒（如伊波拉病毒、寨卡病毒、尼帕病毒、新冠病毒等）的包膜蛋白。

適用于疫苗研發(fā)：VSV可以引發(fā)體液和細(xì)胞免疫，毒性很低，并且在人類群體中只有很低的血清陽(yáng)性率。重組VSV是理想的用于研制人類疫苗的病毒載體。

載體容量有限：VSV基因組長(zhǎng)度為11 kb，超出該尺度的長(zhǎng)片段基因或多基因插入將降低病毒包裝后的病毒滴度，不利于后續(xù)應(yīng)用。

不適用于研究病毒的傳染病模型：由于重組VSV只能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制一次，因此對(duì)于實(shí)際的病毒感染機(jī)體過(guò)程的反映能力相當(dāng)有限。

技術(shù)復(fù)雜：生產(chǎn)重組VSV有相當(dāng)多的中間步驟，包括從質(zhì)粒初步制備VSV、斑塊純化、生產(chǎn)G糖蛋白補(bǔ)全的VSV、使用異源病毒的包膜蛋白組裝VSV假病毒等。這些步驟相對(duì)于傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染要求運(yùn)用到更復(fù)雜的技術(shù)。

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It can drive high-level transcription of the downstream viral antigenomic RNA in packaging cells.

T7 promoter: Promoter from T7 bacteriophage. The T7 RNA polymerase from the phage recognizes this promoter to drive high-level transcription of the downstream viral antigenomic RNA.

VSV-N: Nucleoprotein gene of vesicular stomatitis virus. Assembles into an intact RNase-resistant nucleocapsid as N/RNA polymer; required for initiating viral genome synthesis.

VSV-P: Phosphoprotein gene of vesicular stomatitis virus. Functions as a critical component of the VSV polymerase complex by positioning the large (L) protein on the N/RNA template and stimulating viral RNA synthesis with the L protein at both the initiation and elongation steps.

VSV-M: Matrix protein gene of vesicular stomatitis virus. Associates with the N/RNA nucleocapsid and facilitates virus assembly by promoting condensation of the ribonucleocapsid.

Kozak: Kozak translation initiation sequence. Facilitates translation initiation of ATG start codon downstream of the Kozak sequence.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

VSV-L: Large polymerase protein gene of vesicular stomatitis virus. Forms RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complexes with the VSV phosphoprotein and catalyzes synthesis of the N, P, M, G, L mRNAs sequentially.

HDV: Hepatitis delta virus (HDV) antigenome self-cleaving ribozyme. This ribozyme, when present in the transcript, catalyzes the self-cleavage of the transcript in cis.

T7 terminator: Transcriptional termination signal from T7 bacteriophage. Allows transcription termination of RNA transcribed by bacteriophage T7 RNA polymerase.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. Transcription driven by the CMV promoter is terminated within this sequence.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.