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神經(jīng)研究專用 AAV
由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）的復(fù)雜性，神經(jīng)組織的有限再生能力，血腦屏障（Blood?brain barrier，BBB）對藥物輸送的限制，采用傳統(tǒng)藥物和外科手術(shù)方法治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病仍然很困難，目前科學(xué)家正在研究使 用基因療法治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1] ?；蛑委熌軌?qū)⒒虻恼？截惙湃爰毎瑥亩淖兗毎墓ぷ鞣绞?，達到治愈目的。為了將基因插入細胞，基因療法使用載體將基因放入細胞。
AAV病毒載體是極具應(yīng)用前景的基因給藥工具。野生AAV被認為是非致病性的，感染個體后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平極低，無法自行復(fù)制，需依賴于與腺病毒或皰疹病毒的共同感染才能復(fù)制。
重組AAV載體自身只需攜帶一個順式元件，ITR，就能生產(chǎn)出重組AAV顆粒。由于缺乏Rep基因，重組 AAV 病毒基因組 不整合宿主基因組，以染色體外形式長期存在，在非分裂細胞（如神經(jīng)元）中也能實現(xiàn)治療性蛋白的持久表達，安全性極高[2] 。另外，多種血清型 AAV 對神經(jīng)細胞具有良好嗜性。
載體家長期致力于高質(zhì)量的 AAV 載體構(gòu)建、AAV 病毒包裝，旨在讓您的研究更高效。
ssAAV vs. scAAV
與傳統(tǒng)的單鏈（single-stranded，ss）基因組 AAV 載體相比，自我互補（self-complementary，sc）AAV載體具有更高 的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和更快的轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)。ssAAV載體通過宿主介導(dǎo)的DNA合成方式轉(zhuǎn)化為活性的雙鏈 DNA 形式。因此，雙鏈 DNA 的生成是 ssAAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)中的限制步驟。由于基因組只能使用一半，scAAV 適合作為小基因的載[3] 。載體家提供 ssAAV、scAAV 兩種 AAV 載體構(gòu)建以及病毒包裝服務(wù)。
神經(jīng)嗜性 AAV 血清型
載體家提供的 AAV 血清型多達 18 種 : 1-9、6.2、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、 AAV2.7m8。
不同的血清型具有相似的結(jié)構(gòu)和大小。然而，由于衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)不同，它們具有不同的嗜性。早期的 CNS AAV 研究使 用的是自然血清型的第一代載體（AAV2）和第二代載體（AAV5 或 AAV8） 。近十年中，第三代載體（AAV9）被確定在腦和 脊髓中分布廣泛，同時靶向神經(jīng)元和星形細胞。與其他自然血清型不同，AAV9 在靜脈注射后很容易穿過血腦屏障，具有 微創(chuàng)治療的前景。因此，AAV9 已成為 AAV 介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的金標準[4] 。我們對 AAV9 進行了神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo) 測試，效果如下：
載體家測試尾靜脈注射 AAV9-CAG-EGFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)效果。取出生 48 小時內(nèi)的新生小鼠，體重約 1.5 g，靜脈注射，注射劑量約 1 x 1011 vg/g。10 天后處死取材，制備冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察。
神經(jīng)特異性啟動子
載體家不僅提供廣泛表達啟動子，如 CMV、EF1A、EFS、CAG、CBh 等，還能提供多種神經(jīng)特異性啟動子，幫助您高效構(gòu)建 AAV 載體。
| 啟動子名稱 | 描述 | 組織嗜性 | 細胞嗜性 |
|---|---|---|---|
| Nes | Rat nestin intron 2 enhancer fused to mouseHsp68minimal promoter | Nervous system at embryonic stage | Neural stem/progenitor cells |
| Tuba1a | Rat α1A tubulin promoter | Nervous systems at embryonic and early postnatal stages | Developing neurons but not astrocytes or oligodendrocytes |
| Camk2a(long) | Mouse α-calcium-calmodulin dependentkinase II promoter (8 kb) | Forebrain | CA1 pyramidal cells of the hippocampus |
| Camk2a(short) | Mouse α-calcium-calmodulin dependentkinase II promoter (1.3 kb) | Brain | Pyramidal neurons |
| SYN1 | Human synapsin I promoter | Brain | Mature neurons |
| Hb9 | Mouse Hb9 enhancer fused to mouse Hsp68minimal promoter | Spinal cord | Motor neurons |
| Th | Mouse tyrosine hydroxylase promoter | Brain | Dopaminergic neurons |
| NSE | Rat neuron-speci?c enolase promoter | Nervous system | Various neurons |
| GFAP(long) | Human glial ?brillary acidic proteinpromoter (2.1 kb) | Brain | Astrocytes |
| GFAP(short) | Human glial ?brillary acidic proteinpromoter (0.68 kb) | Brain | Astrocytes |
| Iba1 | Mouse ionized calcium bindingadapter molecule 1 promoter | Brain | Microglia |
| ProA1 | Mouse Gnat2 promoter | Retina | Cone photoreceptor |
| hRHO | Human rhodopsin promoter | Retina | Rod photoreceptor |
| hBEST1 | Human bestrophin 1 promoter | Retina | RPE |
| Prnp | Mouse prion protein promoter | Brain, hippocampus, cerebellum, retina | Various CNS neurons |
| Cnp | Mouse 2′,3′-cyclic nucleotide 3′-phosphodi-esterase promoter | Nervous systems,testis and thymus | Oligodendrocytes and Schwann cells |
神經(jīng)病毒遞送方式
為了將病毒載體遞送至CNS，需要使用機械的或生物學(xué)的手段繞過BBB障礙。
繞過BBB的機械方法包括直接向腦實質(zhì)內(nèi)立體定向注射，向CSF注射或改變BBB以允許血管內(nèi)遞送。生物學(xué)手段包括 在肌肉內(nèi)注射后利用經(jīng)歷逆行轉(zhuǎn)運的載體來轉(zhuǎn)導(dǎo)運動神經(jīng)元，并且采用可以穿越完整血腦屏障的載體[5]。
| 注射方式 | 優(yōu)點 | 不足 |
|---|---|---|
| 直接注射Direct injection | 有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)小區(qū)域 | 侵入性 |
| 顱內(nèi)注射Intracisternal injection | 注射到腦內(nèi)的CSF中可以使載體廣泛分布 在整個CNS中 | 對腦實質(zhì)的滲透有限 |
| 腦室內(nèi)注射Intraventricular injection | ||
| 鞘內(nèi)注射Intrathecal injection | 通過CSF分配載體，主要靶向脊髓和背根 神經(jīng)節(jié)（DRG） | - |
| 肌內(nèi)注射Intramuscular injection | 通過逆行轉(zhuǎn)運（Retrograde transport） 靶向運動和感覺神經(jīng)元 | - |
| 血管內(nèi)給藥Intravascular administration | 可在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中實現(xiàn)廣泛的轉(zhuǎn)導(dǎo) | 需要高劑量的載體和外周暴露于載體 |
血腦屏障與腦脊液
保羅·埃里希（Paul Ehrlich）于1885年描述了血腦屏障的概念，當(dāng)時他觀察到注入到血管系統(tǒng)中的染料被除腦外的所有器官迅速吸收。后來發(fā)現(xiàn)，注入腦脊液（Cerebrospinal ?uid, CSF）的染料可自由進入神經(jīng)組織，但不會進入大腦的血液供[6]。血腦屏障由三層組成，它們將大腦、脊髓、腦脊液與血液分開，主要位于內(nèi)皮細胞獨特的緊密連接處。這些被稱為腦毛細血管內(nèi)皮層，脈絡(luò)膜叢上皮和蛛網(wǎng)膜的層各由一層緊密連接的細胞組成。大型或疏水性分子，例如病毒、大型藥物和許多蛋白質(zhì)，通常無法被動地從血液中穿過血腦屏障進入大腦[5]。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)與神經(jīng)元
神經(jīng)系統(tǒng)可以分為兩部分：中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)（Peripheral nervous system，PNS）。我們的神經(jīng)系統(tǒng)的主要功能是從感覺感受器向大腦和脊髓傳導(dǎo)刺激，然后將沖動傳導(dǎo)回身體其他部位。構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)的細胞主要有兩種類型：神經(jīng)元（Neuron）和神經(jīng)膠質(zhì)細胞（Glial cell）。
人類神經(jīng)系統(tǒng)中大約有一萬億個神經(jīng)元。這些重要的細胞使神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的交流得以實現(xiàn)。神經(jīng)元的電傳導(dǎo)非常好。這允許它們通過產(chǎn)生電信號非常迅速地傳播到可能相距一定距離的細胞，從而對刺激做出反應(yīng)。神經(jīng)元分為三個基本部分：細胞體（Cell body）、樹突（Dendrite）和軸突（Axon）。
細胞體是神經(jīng)元的主體部分，細胞存活所需的關(guān)鍵器官位于細胞體內(nèi)。
樹突類似于天線從細胞主體向外突出。它們增加了可用于接收其他神經(jīng)元信號的表面積。一個神經(jīng)元有時可以具有多達40 萬個樹突。
軸突也被稱為神經(jīng)纖維。它是一種細長的管狀結(jié)構(gòu)，從細胞主體延伸到其他細胞。它傳導(dǎo)遠離神經(jīng)元的電信號，稱為動作電位（Action potential）。軸突的長度可以變化，范圍從小于一毫米到大于一米。
除神經(jīng)元外，神經(jīng)膠質(zhì)細胞是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)的另一種主要細胞類型。膠質(zhì)細胞也稱為神經(jīng)膠質(zhì)細胞，構(gòu)成了CNS中約90％的細胞。但是，它們僅占據(jù)大腦中大約一半的空間，因為它們不像神經(jīng)元那樣具有廣泛的分支。與神經(jīng)元不同，神經(jīng)膠質(zhì)細胞不傳導(dǎo)神經(jīng)電信號。相反，它們起到保護和滋養(yǎng)神經(jīng)元的作用[6]。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)由大腦和脊髓構(gòu)成。大腦是一個非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，但我們可以將其解剖結(jié)構(gòu)劃分為灰質(zhì)（Grey matter）和 白質(zhì)（White matter）?；屹|(zhì)主要由神經(jīng)元細胞體組成，細胞體是一個容納神經(jīng)元核的球形結(jié)構(gòu)。大腦的白質(zhì)區(qū)域主要由帶鞘的軸突組成，由于鞘含有相對較高的脂肪含量而呈白色[7]。
References
[1] Ingusci S, Verlengia G, Soukupova M, Zucchini S, Simonato M. Gene Therapy Tools for Brain Diseases. Front Pharmacol. 2019 Jul 1;10:724.
[2] Chamberlain K, Riyad JM, Weber T. Cardiac gene therapy with adeno-associaed virus-based vectors. Curr Opin Cardiol. 2017 May;32(3):275-282.
[3] Katz MG, Fargnoli AS, Weber T, Hajjar RJ, Bridges CR. Use ofAdeno-Associated Virus Vector for Cardiac Gene Delivery in Large-Animal Surgical Models of Heart Failure. Hum Gene Ther Clin Dev. 2017 Sep;28(3):157-164.
[4] Lykken EA, Shyng C, Edwards RJ, Rozenberg A, Gray SJ. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. J Neurodev Disord. 2018 May 18;10(1):16.
[5] Gray SJ, Woodard KT, Samulski RJ. Viral vectors and delivery strategies for CNS gene therapy. Ther Deliv. 2010 Oct;1(4):517-34.
[6] Anatomy of the central nervous system (CNS, spinal Cord): MyVMC. (2019, May 6). https://heal-thengine.com.au/info/central-nervous-system-cns.
[7] Mackenzie, R. J. (2019, August 30). Gray Matter vs White Matter. Neuroscience from Technology Networks.https://www.technologynetworks.com/neuroscience/articles/gray-matter-vs-white-matter-322973.
