與游離的病毒不同（例如單純性皰疹病毒，腺病毒），逆轉(zhuǎn)錄病毒具有能將遺傳物質(zhì)整合到宿主基因組的能力，使轉(zhuǎn)基因能夠穩(wěn)定、長(zhǎng)期地表達(dá)。因此，簡(jiǎn)單的逆轉(zhuǎn)錄病毒（即所謂的γ或者致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒）在當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)中扮演了重要角色。但是，簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒不能感染非分裂細(xì)胞以及有誘發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的這些特點(diǎn)限制了它們的應(yīng)用。使用慢病毒能夠繞過簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒的這些短板。慢病毒是一類復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，除包含gag、pol和env這些簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒的常規(guī)基因外，還包含額外的調(diào)控基因和輔助基因。與簡(jiǎn)單逆轉(zhuǎn)錄病毒不同的是，慢病毒能感染分裂和非分裂細(xì)胞，大大增加了基因可轉(zhuǎn)移的細(xì)胞范圍。慢病毒傾向整合到染色體中的內(nèi)含子區(qū)域（表達(dá)基因富含內(nèi)含子），而簡(jiǎn)單的逆轉(zhuǎn)錄病毒則更偏好啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)域。廣泛使用的慢病毒載體是通過將人類免疫缺陷病毒類型1（HIV-1）工程化而來的。

HIV-1結(jié)構(gòu)

HIV-1病毒粒子大致呈球形，直徑約為100 nm，外面包裹著在出芽過程中從宿主細(xì)胞衍生而來的脂質(zhì)雙層膜。該包膜表面攜帶許多小的糖蛋白凸起物。病毒通過這些糖蛋白識(shí)別新的宿主細(xì)胞。脂質(zhì)層下的基質(zhì)蛋白覆蓋病毒包膜的內(nèi)表面，形成一個(gè)保護(hù)殼。在病毒粒子的內(nèi)部，是一個(gè)由結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的錐形衣殼，里面裝載著病毒基因組。兩條長(zhǎng)度為9.2Kb的單鏈RNA基因組、核衣殼蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶以及整合酶被共同裝載在衣殼中。

圖1. HIV-1結(jié)構(gòu)

HIV-1基因組

HIV-1基因組是單組分、線性、二聚體的ssRNA（+），長(zhǎng)度約為9.2Kb（HIV-1前病毒基因組的大小約為9.7Kb），帶有5’帽子和3’poly-A尾。蛋白編碼區(qū)側(cè)翼序列為5’和3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）。LTR包含3’特異元件（U3）、重復(fù)元件（R）和5’特異元件（U5），還包含一些順式作用元件。一個(gè)病毒的RNA基因組起始于5’LTR 中R區(qū)的第一個(gè)核苷酸，終止于3’LTR中R區(qū)的最后一個(gè)核苷酸，包括了編碼19種蛋白產(chǎn)物的9種基因。gag、pol和env基因編碼所有逆轉(zhuǎn)錄病毒具有的常規(guī)結(jié)構(gòu)蛋白和酶。其他額外的基因編碼必需的調(diào)控蛋白（tat和rev基因）和輔助蛋白（vif、vpu、vpr和nef基因）。由于病毒基因組很緊湊，HIV-1通過利用宿主細(xì)胞的RNA剪接機(jī)器來表達(dá)數(shù)量眾多的基因。

圖2. HIV-1基因組

HIV-1生命周期

當(dāng)病毒包膜上的糖蛋白gp120與宿主細(xì)胞表面的CD4受體和一個(gè)二級(jí)受體結(jié)合時(shí)，病毒開始復(fù)制。這種連續(xù)的結(jié)合觸發(fā)了病毒和宿主細(xì)胞膜的融合，隨后將病毒核心釋放到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。一旦進(jìn)入，病毒衣殼遭遇“脫殼”，在此期間大多數(shù)的衣殼脫落，而核衣殼、病毒蛋白R(shí)、整合酶以及一小部分基質(zhì)仍連在一起。隨著脫殼過程的不斷進(jìn)行，病毒基因組RNA（gRNA）逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），新合成的病毒cDNA以先導(dǎo)整合復(fù)合體（PIC）的形式保持與病毒和細(xì)胞蛋白的聯(lián)系。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄全部完成之后，一段長(zhǎng)度約為100 nt的三鏈DNA（被稱為中心DNA瓣）在cPPT/CT區(qū)域形成，它是病毒DNA核運(yùn)輸所必需的。PIC通過核孔復(fù)合體（NPC）進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)而不會(huì)破壞核膜，然而許多其他逆轉(zhuǎn)錄病毒則需要在有絲分裂時(shí)期借助核膜的破壞來接近宿主染色體。一旦進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，PIC即發(fā)生解體，HIV整合酶將病毒cDNA整合到宿主細(xì)胞的基因組中。

病毒DNA整合之后，HIV前病毒能夠保持轉(zhuǎn)錄沉默，或者激活轉(zhuǎn)錄進(jìn)入生命周期的完成階段。HIV基因組轉(zhuǎn)錄涉及RNA聚合酶II（RNAP II）與病毒蛋白Tat以及一些宿主蛋白共同合作。病毒啟動(dòng)子5’LTR中有能夠被RNAP II激活的啟動(dòng)子的經(jīng)典結(jié)構(gòu)。在Tat缺乏的情況下，從LTR的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)盡管有效，但會(huì)因?yàn)閱?dòng)子與進(jìn)行性聚合酶結(jié)合不良以及這些酶過早的從DNA模板上脫落而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受損。Tat蛋白最初是從已整合的病毒DNA表達(dá)，并且與早期的RNA轉(zhuǎn)錄本中的TAR發(fā)夾結(jié)構(gòu)相結(jié)合，增加RNAP II的持續(xù)合成能力。病毒RNA的轉(zhuǎn)錄開始于5’LTR中R區(qū)的第一個(gè)核苷酸，多聚腺苷酸化發(fā)生在3’LTR中R區(qū)的最后一個(gè)核苷酸。前病毒DNA經(jīng)RNAP II轉(zhuǎn)錄生成一條未剪接的長(zhǎng)鏈RNA，既能被用作包裝進(jìn)病毒粒子中的gRNA，還可以作為Gag和Gag-Pol轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本，或者經(jīng)剪接產(chǎn)生超過40個(gè)不同的mRNA以被用于產(chǎn)生余下的病毒蛋白。HIV-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（包括Rev）由加工完全的mRNA轉(zhuǎn)錄本翻譯而來，而結(jié)構(gòu)蛋白則是由不完全剪接的轉(zhuǎn)錄本翻譯而來。完全剪接的轉(zhuǎn)錄本通過與細(xì)胞內(nèi)mRNA相同的機(jī)制由細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。一般而言，包含內(nèi)含子的RNA（未剪接的或者不完全剪接）被保留在細(xì)胞核內(nèi)。然而，HIV-1已經(jīng)發(fā)展出了一套特別的機(jī)制，即利用Rev調(diào)控蛋白與一個(gè)結(jié)構(gòu)化的順式作用RNA元件也就是熟知的Rev反應(yīng)元件（RRE）相結(jié)合來克服這個(gè)問題。

一經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，未剪接的gRNA采用以下兩種途徑中的一種：1)作為一個(gè)mRNA模板用于翻譯Gag蛋白，以及通過核糖體移碼翻譯成Gag-Pol，以編碼病毒蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶以及整合酶；2）作為gRNA被包裝成病毒粒子。兩條HIV gRNA被包裝成一個(gè)二聚體，在5’末端（這些序列即為Ψ（psi），用作“包裝信號(hào)”）附近以非共價(jià)連接方式結(jié)合。Ψ元件僅存在于未剪接的gRNA中。在單體gRNA中，Ψ元件被分子內(nèi)堿基對(duì)隱藏起來，之后經(jīng)2個(gè)拷貝的gRNA二聚化才會(huì)暴露出來，以允許未剪接的gRNA二聚體與Gag多聚蛋白的NC區(qū)特異性的、高度親和的結(jié)合。多條Gag多聚蛋白能與gRNA的一個(gè)二聚體相互作用。該復(fù)合體被肌動(dòng)蛋白或者微管運(yùn)輸?shù)阶罱K病毒粒子組裝和出芽發(fā)生的細(xì)胞膜。病毒粒子一旦釋放，蛋白酶被激活并將Gag和Gag-Pol裂解成單鏈，在病毒粒子內(nèi)部自我組裝形成衣殼，導(dǎo)致有感染性的病毒顆粒的產(chǎn)生。

慢病毒包裝系統(tǒng)

通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染編碼病毒組件的質(zhì)粒，重組慢病毒顆粒能夠從正確包裝的細(xì)胞中生產(chǎn)出來。慢病毒包裝系統(tǒng)建立于一個(gè)“切割”系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中自然的病毒基因組序列被分割后裝進(jìn)幾個(gè)單獨(dú)的輔助質(zhì)粒，這樣增加了慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的安全性。第三代包裝系統(tǒng)所需的元件包括：

轉(zhuǎn)移載體

轉(zhuǎn)移質(zhì)粒表達(dá)全長(zhǎng)的gRNA，該gRNA包含用于有效包裝、逆轉(zhuǎn)錄、核運(yùn)輸和整合到宿主基因組DNA所必須的所有順式作用元件。通常，該質(zhì)粒包含一個(gè)攜帶由內(nèi)部啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。早期的載體包含完整的5’和3’LTR。因而轉(zhuǎn)錄是Tat依賴的，并且病毒能夠自我復(fù)制。為了進(jìn)一步提高包裝慢病毒的生物安全性，不依賴Tat的病毒gRNA轉(zhuǎn)錄通過用一個(gè)強(qiáng)的異源性啟動(dòng)子（例如RSV啟動(dòng)子）替代5’LTR中U3區(qū)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列來得以實(shí)現(xiàn)。此外，3’LTR中的大部分U3區(qū)被刪除掉。該U3缺失體在逆轉(zhuǎn)錄時(shí)能被復(fù)制到5’LTR，使得前病毒自我復(fù)制失效（所謂的“自我失活”）。

包裝質(zhì)粒

包裝質(zhì)粒能表達(dá)感染顆粒形成所必需（除Env之外）的病毒酶和結(jié)構(gòu)蛋白。早期的第一代慢病毒載體系統(tǒng)的包裝質(zhì)粒含有輔助蛋白和調(diào)控蛋白的表達(dá)元件。為盡量減少生產(chǎn)和使用慢病毒載體的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，所有編碼輔助蛋白和與細(xì)胞毒性相關(guān)的非必需基因均被移除，第三代包裝系統(tǒng)由此產(chǎn)生。在該系統(tǒng)中，包裝元件被分隔在兩個(gè)質(zhì)粒中，一個(gè)Gag-Pol表達(dá)質(zhì)粒和一個(gè)Rev表達(dá)質(zhì)粒，盡可能的降低一個(gè)具有復(fù)制能力的慢病毒（RCL）重新形成的風(fēng)險(xiǎn)。

包膜載體

包膜載體能表達(dá)一個(gè)異源性糖蛋白，即水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-G)，該蛋白能與細(xì)胞表面廣泛存在的磷脂組分而不是一個(gè)特異性的細(xì)胞表面受體相結(jié)合。此類病毒宿主細(xì)胞的范圍十分廣泛，包含的細(xì)胞類型例如有神經(jīng)元、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。此外，VSV-G增加了病毒顆粒的物理穩(wěn)定性，以允許使用高速離心對(duì)病毒進(jìn)行濃縮。

圖3. 第三代慢病毒包裝系統(tǒng)

轉(zhuǎn)染用慢病毒載體的產(chǎn)品規(guī)格、運(yùn)輸方式和儲(chǔ)存條件在下表中列出。

• 轉(zhuǎn)染用包裝混合物包含了優(yōu)化混合的第三代包裝質(zhì)粒和VSV-G衣殼表達(dá)載體。這些質(zhì)粒提供輔助功能以及產(chǎn)生VSV-G慢病毒所必需的結(jié)構(gòu)和復(fù)制蛋白。
• 轉(zhuǎn)染用EGFP慢病毒載體包含一個(gè)EGFP表達(dá)盒。該表達(dá)盒能夠包裝進(jìn)病毒顆粒，進(jìn)而轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。利用該質(zhì)粒，可實(shí)時(shí)測(cè)量轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，從而優(yōu)化病毒包裝和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。
• 轉(zhuǎn)染用的scramble shRNA慢病毒載體包含一個(gè)scramble shRNA表達(dá)盒和一個(gè)EGFP表達(dá)盒。這些表達(dá)盒能夠包裝進(jìn)病毒顆粒，進(jìn)而轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該質(zhì)?？捎米鱎NAi實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。

我們建議在實(shí)驗(yàn)中使用EGFP慢病毒載體作為對(duì)照組來幫助您評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)您從我們的載體工匠網(wǎng)站（vectorbuilder.com）訂制病毒包裝服務(wù)時(shí)，即可免費(fèi)獲得EGFP慢病毒。

1. 轉(zhuǎn)染前一天（第0天）

• 將293T HEK細(xì)胞接種在10 cm組織培養(yǎng)皿中，保證在轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞匯合度達(dá)到90-95%。我們建議在10 ml包含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中接種5 × 10⁶個(gè)細(xì)胞。
  注意：培養(yǎng)基中不含抗生素。
• 保持培養(yǎng)皿水平的同時(shí)，前后左右地?fù)u晃培養(yǎng)皿，讓細(xì)胞均勻地鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿；在37°C，5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育過夜。
• （可選）用多聚L-賴氨酸預(yù)處理培養(yǎng)皿表面以增強(qiáng)293T HEK細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的粘性。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10 ml 多聚L-賴氨酸，室溫下孵育15分鐘并棄掉液體。

2. 轉(zhuǎn)染當(dāng)天（第1天）

• 轉(zhuǎn)染前當(dāng)天觀察接種的培養(yǎng)皿。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90-95%時(shí)可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。此時(shí)細(xì)胞之間仍有1-2次細(xì)胞分裂的空間。
• 移除培養(yǎng)液，替換成8 ml無抗生素的血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
• 在5 ml離心管中加入包裝混合物和轉(zhuǎn)移載體來準(zhǔn)備質(zhì)粒DNA混合物。對(duì)于10 cm的培養(yǎng)皿，使用15 ug轉(zhuǎn)移載體和20 ug的包裝混合物。
• 將轉(zhuǎn)染混合物一滴一滴地加入到細(xì)胞中，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。輕柔旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，在37°C、5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育過夜。
  注意：在5%的CO₂中孵育是必需的，這是由于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的pH會(huì)影響CaPO4沉淀物形成的效率。

3. 轉(zhuǎn)染后一天（第2天）

• 觀察細(xì)胞。若轉(zhuǎn)移載體包含一個(gè)熒光標(biāo)記（例如EGFP），則通過在熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞來檢查轉(zhuǎn)染效率。通常情況下，超過90%的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。
  注意：VSV-G糖蛋白會(huì)導(dǎo)致293T HEK細(xì)胞融合，而造成多核的合胞體的出現(xiàn)。這種形態(tài)學(xué)上的變化屬于正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響慢病毒的產(chǎn)生。如果沒有觀察到合胞體，則病毒的產(chǎn)出有可能受影響。
• 移除含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，替換成10 ml不含抗生素的完全培養(yǎng)基。
• 37°C、5% CO₂ 培養(yǎng)箱中孵育。

4. 第3-4天

• 轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)（第3-4天），將培養(yǎng)基移入一個(gè)15 ml 帶蓋的圓錐形無菌管中，收集含有病毒的上清液。
  警告：請(qǐng)記住此時(shí)您正在操作有感染性的病毒。請(qǐng)按照BSL-2條例操作。
• 4°C、3000 rpm離心病毒上清液15分鐘沉淀細(xì)胞碎片。
• 用0.45 um濾膜進(jìn)一步過濾病毒上清液中的細(xì)胞碎片。初步處理后的病毒上清液可直接轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，也可根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)一步濃縮或者純化病毒。