腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，衣殼（capsid）呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑約80-110 nm。衣殼含有240個(gè)聯(lián)體（hexon）、12個(gè)聯(lián)體（penton）及12根纖毛（fiber），除此之外還有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六聯(lián)體是形成病毒衣殼20個(gè)三角形面的主要蛋白，12個(gè)頂端是5個(gè)聯(lián)體亞單位和3個(gè)纖毛蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛以五聯(lián)體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)（knob）。五聯(lián)體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。腺病毒的基因組以線性的雙鏈DNA形式存在，由蛋白VII和一種稱為mu的小蛋白緊密地環(huán)繞在其周圍，起到類組蛋白樣的作用。另一種蛋白V將這種DNA-蛋白復(fù)合物連接起來，并通過蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。在兩條鏈的5’ 端各以共價(jià)鍵結(jié)合著一個(gè)被稱為DNA末端蛋白（pTP）復(fù)合物（DNA-TPC）的特化的結(jié)構(gòu)，與腺病毒復(fù)制密切相關(guān)。腺病毒基因組的兩端各有一段100 bp的反向末端重復(fù)序列（ITR），是復(fù)制的起始位點(diǎn)。在左端ITR的3’ 側(cè)有一段長約300 bp的包裝信號（ψ）介導(dǎo)腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號（ψ）的約0.5 kb的序列是順式作用元件，也就是說必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助病毒（或細(xì)胞）反式補(bǔ)足。

腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)

1. 宿主范圍廣, 對人致病性低

腺病毒載體系統(tǒng)可廣泛用于人類及非人類蛋白的表達(dá)。腺病毒可感染一系列哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此在大多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中均可用來表達(dá)重組蛋白。特別需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞性，而人類的大多數(shù)的腫瘤就是上皮細(xì)胞來源的。另外，腺病毒的復(fù)制基因和致病基因均已相當(dāng)清楚，在人群中早已流行（70-80%成人體內(nèi)都有腺病毒的中和抗體存在）。人類感染野生型腺病毒后僅產(chǎn)生輕微的自限性癥狀，且病毒唑治療有效。

2. 在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因

逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染增殖性細(xì)胞，因此DNA轉(zhuǎn)染不能在非增殖細(xì)胞中進(jìn)行，而必須使細(xì)胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。腺病毒則能感染幾乎所有的細(xì)胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。腺病毒是研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的最佳系統(tǒng)，它可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和原代細(xì)胞中得到的結(jié)果直接進(jìn)行對比。

3. 能有效進(jìn)行增殖，滴度高

腺病毒系統(tǒng)可生產(chǎn)10¹⁰到10¹¹ VP/ml的病毒，滴度較高，適用于基因治療。　　

4. 與人類基因同源

腺病毒載體系統(tǒng)一般應(yīng)用人類病毒作為載體，以人類細(xì)胞作為宿主，因此為人類蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了一個(gè)理想的環(huán)境。大多數(shù)人類蛋白都可達(dá)到高水平表達(dá)并且具有完全的功能。

5. 不整合到染色體中，無插入致突變性

逆轉(zhuǎn)錄病毒可隨機(jī)整合到宿主染色體，導(dǎo)致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中，因此不會(huì)干擾其它的宿主基因。在卵細(xì)胞中整合單拷貝病毒則是產(chǎn)生具有特定特征的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)較好的系統(tǒng)。

6. 能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增

293細(xì)胞可以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，這一調(diào)整可使病毒大量擴(kuò)增。大量事實(shí)證明懸浮293細(xì)胞可在1～20 L的生物反應(yīng)器中表達(dá)重組蛋白。

7. 能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因

這是第一個(gè)可以在同一細(xì)胞株或組織中用來設(shè)計(jì)表達(dá)多個(gè)基因的表達(dá)系統(tǒng)。最簡單的方法是將含有兩個(gè)基因的雙表達(dá)盒插入腺病毒轉(zhuǎn)移載體中，或者用不同的重組病毒共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞株來分別表達(dá)一個(gè)蛋白。測定不同重組病毒的MOI比值可正確估計(jì)各重組蛋白的相對共表達(dá)情況。

正是由于具有以上一些優(yōu)點(diǎn)，腺病毒被極其廣泛地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗、和基因治療等各個(gè)領(lǐng)域。

分類及致病性

自上個(gè)世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)并成功分離腺病毒以來，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)血清型，其中人腺病毒有47種，分為A、B、C、D、E和F六個(gè)亞群（subgroup）?；蛑委煶Ｓ玫娜说?型及5型腺病毒在血清學(xué)分類上均屬C亞群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常強(qiáng)，滴度通常可以達(dá)到10⁹ PFU/ml，其在單個(gè)細(xì)胞中的基因組拷貝數(shù)可達(dá)10⁴（約占細(xì)胞總DNA的10%）。病毒顆粒比較穩(wěn)定，通過CsCl梯度離心可以達(dá)到10¹⁰~10¹¹ PFU/ml，滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求。

2型和5型腺病毒的致病性主要表現(xiàn)為可以導(dǎo)致兒童上呼吸道感染。在感染的最初幾天，由于病毒大量復(fù)制和釋放，會(huì)出現(xiàn)中度發(fā)熱、渾身酸痛、乏力、咽痛等癥狀。但這些癥狀通常是比較短暫而輕微的，在以后的幾天里，會(huì)隨著中和抗體的產(chǎn)生而逐漸消失。雖然可以說高滴度和高免疫原性是腺病毒的主要特點(diǎn)，但也是相對的，如8型腺病毒（主要感染小腸和結(jié)膜組織）可以在扁桃體等淋巴組織中潛伏下來。在C亞群的其他一些腺病毒中也可以見到同樣的現(xiàn)象，這是因?yàn)椴《镜腅3區(qū)編碼的功能可使其逃避宿主的免疫打擊。這似乎有助于理解為何腺病毒載體在造血系細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯低于其他組織、細(xì)胞。

分類及致病性

腺病毒的生活周期可以分為兩個(gè)截然不同卻又不能割裂開來的兩個(gè)階段。第一階段包括腺病毒顆粒粘附和進(jìn)入宿主細(xì)胞，將基因組釋放到宿主細(xì)胞核中，以及有選擇性地轉(zhuǎn)錄和翻譯早期基因。在這個(gè)階段，細(xì)胞為病毒基因組復(fù)制和腺病毒晚期基因表達(dá)并最終釋放成熟的感染顆粒，即第二階段，作好了準(zhǔn)備。第一階段將在6~8個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，第二階段則更快，只需4~6個(gè)小時(shí)。

粘附和進(jìn)入細(xì)胞

腺病毒感染細(xì)胞的過程是從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體開始的。因?yàn)槿讼俨《局饕c柯薩奇B病毒共用一種受體，因此這種受體被稱為柯薩奇/腺病毒受體即CAR（Coxsackie/Adenovirus receptor）。接下來病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD與細(xì)胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結(jié)合，通過內(nèi)吞作用將腺病毒內(nèi)化到細(xì)胞中并進(jìn)入溶酶體。在溶酶體的酸性環(huán)境下，腺病毒衣殼的構(gòu)象將發(fā)生變化，被從溶酶體中釋放出來，躲過溶媒體的消化作用。最后，腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過核孔將病毒DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)。相對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核是一個(gè)非常高效的過程，一般可以達(dá)到40%，前者雖然進(jìn)入胞質(zhì)的效率與后者相當(dāng)，而DNA進(jìn)入細(xì)胞核的效率卻只有前者的1/1000。

轉(zhuǎn)錄與復(fù)制

一旦病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核，就將進(jìn)行一系列的復(fù)雜而有序的逐級放大的剪切和轉(zhuǎn)錄過程。一般的，以病毒DNA開始復(fù)制為分界線，按轉(zhuǎn)錄時(shí)間的先后，將腺病毒基因大致區(qū)分為早期（E1~4）和晚期轉(zhuǎn)錄單位（L1~5）。各種腺病毒基因又可以進(jìn)一步地分為更小的轉(zhuǎn)錄單位，如E1區(qū)可以進(jìn)一步分為E1A和E1B，每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位都至少有一個(gè)獨(dú)特的啟動(dòng)子。腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核后，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子首先與E1A區(qū)上游的增強(qiáng)子結(jié)合，表達(dá)E1A蛋白，該蛋白的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，使病毒DNA更易于在細(xì)胞中復(fù)制。E1A蛋白還可以激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的啟動(dòng)子，其中E2B驅(qū)動(dòng)另外三個(gè)與病毒復(fù)制有關(guān)的早期基因轉(zhuǎn)錄單位末端蛋白前體（Precursor terminal protein，pTP）、單鏈DNA結(jié)合蛋白（Single-stranded DNA binding proteins，ssDBP）以及DNA聚合酶的表達(dá)，這三個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物緊密地結(jié)合成一個(gè)復(fù)合物，與至少三種細(xì)胞蛋白相互作用，啟動(dòng)病毒基因組的復(fù)制。

一般而言，DNA的復(fù)制是由RNA啟動(dòng)的，而在腺病毒卻是所謂的蛋白啟動(dòng)（protein-priming）。如前所述，腺病毒雙鏈DNA的每條單鏈的5’ 端有pTP蛋白結(jié)合，pTP通過其Ser-OH與DNA 5′端的dCMP 5’ 磷酸之間形成磷酸二脂鍵。腺病毒的DNA復(fù)制首先是以5′端結(jié)合有pTP的dCMP作為引物，以3’ 端的末端反向重復(fù)序列（ITR）為模板，進(jìn)行鏈置換（strand displacement）合成，置換出的單鏈分子可以自我退火環(huán)化，形成鍋柄樣環(huán)形分子，然后這種環(huán)形分子再以相同的機(jī)制合成出子代雙鏈DNA分子。

病毒基因組復(fù)制通常在感染后數(shù)小時(shí)開始，同時(shí)早期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯被關(guān)閉，晚期基因開始表達(dá)。大部分的晚期基因的轉(zhuǎn)錄是以一個(gè)共同的主要晚期啟動(dòng)子（MLP, Major Late Promoter）調(diào)控的。實(shí)際上，MLP的活性與病毒基因組復(fù)制密切相關(guān)，有研究表明一旦腺病毒基因組開始復(fù)制MLP的活性將明顯增強(qiáng)，對此我們將另外行文詳述。晚期基因主要編碼腺病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。病毒結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)聚集形成病毒衣殼，病毒的基因組被包裝進(jìn)去，形成有感染能力的病毒顆粒，并最終裂解宿主細(xì)胞被釋放出去，完成腺病毒的生活周期。腺病毒有明顯的種屬特異性，人的野生型5型腺病毒（Ad5）感染其他的非人類細(xì)胞（如鼠類細(xì)胞）后可以表達(dá)早期基因，基因組也可有一定程度的復(fù)制并能夠形成一些不成熟的病毒顆粒，卻不能形成成熟的病毒顆粒，也不能二次感染其他細(xì)胞。

資料來源：