對于CRISPR介導的基因組編輯，Cas9核酸酶靶向位點特異性引導RNA（gRNA）的靶位點以產生DNA切割。在大多數(shù)情況下，為了產生簡單的基因敲除，可以將單個gRNA與Cas9一起使用以產生雙鏈斷裂（DSB），并通過非同源末端連接（NHEJ）低效修復，導致永久突變 ，如在修復位點產生小插入或缺失。某些突變會產生移碼，終止密碼子提前出現(xiàn)等，從而導致目的基因功能缺失。如果基因組中兩個臨近的位點（如小于幾kb）同時作為靶向位點，使用雙gRNA可能會導致中間區(qū)域片段的缺失（即片段敲除）。

如果使用Cas9_D10A缺刻酶靶向單個靶位點的兩條相對鏈，則可以使用雙gRNA。缺刻酶將在兩條鏈上產生單鏈切割，兩條gRNA分別引導缺刻酶在對應的一條鏈上進行切割，從而引起靶位點處發(fā)生DSB。 通常情況下，這種方法可以減少CRISPR/Cas9的脫靶效應，因為需要兩個gRNA同時打靶才能產生DSB。

當使用Cas9_D10A缺刻酶和外源Donor DNA模板將特定堿基（例如敲入）引入目的基因時，也可以使用雙gRNA。兩個gRNA靶向位于所需突變位點側翼的兩條相對鏈，然后通過同源定向修復（HDR）的方法利用外源模板來修復被切除的序列。

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