并不是所有的shRNA都會(huì)起作用

根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)和來自客戶的反饋，使用3-4個(gè)shRNA進(jìn)行干擾測(cè)試時(shí)，通常只有2-3個(gè)有比較合理的干擾效果。所以，在使用shRNA時(shí)，重要的是要認(rèn)識(shí)到并非所有的shRNA都能正常工作。通常情況下，約50-70％的shRNA具有干擾效果，其中只有約20-30％的shRNA具有比較明顯的效果。如果您使用幾個(gè)shRNA靶向同一個(gè)基因都沒有一個(gè)能產(chǎn)生滿意的干擾效果，最好的解決方式是嘗試更多的shRNA，特別是那些經(jīng)過文獻(xiàn)驗(yàn)證的shRNA。目前，許多研究人員使用靶向相同基因的shRNA庫（即不同shRNA的混合物）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期提高干擾效率。

干擾效率檢測(cè)方法不當(dāng)

最常用評(píng)估shRNA干擾效率的靈敏測(cè)定方法是RT-qPCR，您可能需要嘗試幾對(duì)引物，篩選出最具特異性和效率的引物對(duì)。通常情況下，RT-qPCR引物應(yīng)跨越內(nèi)含子，即設(shè)計(jì)在兩個(gè)外顯子上，以免擴(kuò)增基因組DNA。當(dāng)使用新引物時(shí)，建議您先進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)目的條帶，或者甚至可以通過測(cè)序驗(yàn)證PCR產(chǎn)物是否正確。在進(jìn)行RT-qPCR的同時(shí)，應(yīng)注意設(shè)置minus-RT對(duì)照以評(píng)估基因組DNA的污染水平。您可以使用NCBI引物設(shè)計(jì)工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）來檢查引物質(zhì)量。

干擾效率也可以通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）進(jìn)行評(píng)估。然而，該方法常產(chǎn)生來自非特異性抗體結(jié)合的假陽性條帶，從而導(dǎo)致誤判沒有干擾效果。因此，在使用時(shí)需要確?？贵w的特異性。

您使用的shRNA可能只打靶基因的某個(gè)轉(zhuǎn)錄本

在設(shè)計(jì)shRNA時(shí)，我們推薦您使用那些能靶向單個(gè)基因多個(gè)轉(zhuǎn)錄本的shRNA，除非您只想打靶特定轉(zhuǎn)錄本。VectorBuilder提供針對(duì)常見物種的shRNA數(shù)據(jù)庫。當(dāng)您將shRNA元件插入載體時(shí)，您可以選擇shRNA數(shù)據(jù)庫，通過搜索目的基因查看所有可用的shRNA詳細(xì)信息。您還可以打開其中的UCSC鏈接，查看shRNA序列在基因組和轉(zhuǎn)錄本中位置等信息。